一种转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法技术

本发明专利技术属于丙酮酸的制备方法的技术领域，涉及一种采用来自荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法。利用微生物菌株（ATCC948）—荧光假单胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶（CAT）转化DL-乳酸制备丙酮酸，既提高了产物转化率又保持了产物稳定性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于丙酮酸的制备方法的
，涉及一种利用来自荧光假单胞菌 {Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶(CAT)转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法。
技术介绍
丙酮酸(Pyruvate)是一种重要的医药、化工产品，它不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且可作为多种有用化合物的前体。传统的化学合成丙酮酸的方法是以酒石酸为原料，通过和硫酸氢钾高温下反应得到丙酮酸，这个反应过程中还需要引入氰化钠和乙酰卤化物合成乙酰氰化物，并进一步水解乙酰氰化物，这种工艺原料成本较高，产率也较低。发酵法制取丙酮酸转化率也往往较低，这是因为丙酮酸在糖代谢中处于最活跃的中心节点，在细胞中很容易转化为其他化合物，因此很难累积，而且，丙酮酸作为发酵产物混合物的一种成分，往往是相当低浓度的，从复杂的发酵液中分离提取丙酮酸，一般是难以进行的，费用也较昂贵。酶法生产丙酮酸是近期研究多采用的技术，乳酸脱氢酶能使乳酸(Lactate)—步生成丙酮酸，该酶催化反应如下Lactate + NAD+ <"“Pyruvate + NADH + H+该反应是可逆反应，反应平衡倾向于乳酸一边；辅酶NAD+为小分子化合物，很难固定， 不易再生，而且价格昂贵，这些因素限制了乳酸脱氢酶的应用。乳酸氧化酶作为一种黄素蛋白，是以FMN或FAD作为辅因子，其电子转移的形式不同于经典的电子传递链，而是直接以氧作底物，FMN或FAD和酶蛋白结合非常牢固，整个反应过程不需要游离的外源辅酶参与，这就解决了辅酶再生的问题。细菌细胞内乳酸氧化酶催化的生化反应式为CH3CH20HC00H (乳酸)+ O2........................................... CH3COCOOH (丙酮酸)+ H2O2该反应生成的过氧化氢继续与丙酮酸进行无酶催化反应生成乙酸和二氧化碳。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种利用来自荧光假单胞菌 {Pseudomonas fluorescens)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶(CAT)转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法。本专利技术采用来自荧光假单胞菌iPsmdomorms fluorescens)中的乳酸氧化酶 (LOD)及过氧化氢酶(CAT)转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，利用微生物菌株(ATCC948) — 荧光假单胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶(CAT)转化DL-乳酸制备丙酮酸。本专利技术的转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，其详细步骤为(1)菌种选择选用微生物菌株(ATCC948) —荧光假单胞菌iPsendomonasfluorescens)，采用以乳酸为唯一碳源的培养基进行培养，该菌株具有高乳酸氧化酶活力和过氧化氢酶活力；(2)斜面培养将荧光假单胞菌菌株接种于含有1.5-2. 0%的琼脂糖并加有1. 0-2. 0% DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25-35°C培养20-30小时；(3)一级种子培养将步骤( 培养的菌株，无菌条件下用接种环接1 2环于50 IOOmL含有1. 0-2.0% DL-乳酸钠的液体基本培养基(LLM)中，25_35°C条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得一级种子；(4)扩大培养以3-5%(体积比)接种量，接一级种子于500 mL含有1.0-2.0% DL-乳酸钠的LLM中，25-35°C条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以3-5%(体积比)接种量，接二级种子于2L含有0. 1-0. 5%葡萄糖、 1. 0-2. 0% DL-乳酸钠的LLM中，25_35°C条件下，培养6_8小时补料，补料液为15-25%的乳酸钠溶液，补料速度为0. 2-0. 3 mL/min，培养10-15小时终止发酵培养，这时乳酸氧化酶酶活达到最高，期间以毛细管电泳法(CE)方法检测丙酮酸生成量；(6)收集菌体取步骤(4)的发酵液6000-8000 穿离心10-15分钟，收集菌体沉淀，并用pH7. 4、33mM的磷酸钾缓冲液洗涤2 3次；再将菌体溶于pH7. 4、33mM的磷酸钾缓冲液中，使菌体的浓度达到每升100 200克湿细胞；(7)超声波裂解细胞超声波破碎菌体细胞5-10分钟(脉冲5秒，脉冲间隔5秒)，然后离心30-60分钟(30，000-35, 000 ^)，取上清即得荧光假单胞菌粗酶液，在4°C储存，备用；(8)转化实验将步骤(7)中的荧光假单胞菌粗酶液与DL-乳酸钠混合，使混合物中DL-乳酸钠的终浓度达到5. 54-1，080mM，加入终浓度为0-1. 0 mM的乙二胺四乙酸钠 (EDTA)，粗酶液蛋白浓度达到70-300 mg/L, 37-42°C, pH7. 2条件下，150-200转/分钟振荡 5-160小时；每间隔10分钟-15小时取样检测底物消耗量和产物生成量；(9)样品盐析去除酶蛋白取样样品中加入饱和度为50-60%的硫酸铵沉淀酶蛋白， 6000-8000 1§ 离心10分钟，得到上清液即为样品；(10)样品检测待步骤(9)分离完之后，取1 5μ L样品进样，利用毛细管电泳法(CE) 测定底物乳酸和产物丙酮酸的含量，计算出转化率。液体基本培养基(LLM)配方组成为(为重量百分比)磷酸氢二钾0.05%，氯化钠 0.05%，硫酸镁0.05%，硫酸亚铁0.001%，酵母膏0. 1%，余量为水。乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶(CAT)共同催化转化DL-乳酸制备丙酮酸的反应式如下权利要求1.一种利用来自荧光假单胞菌ipseudomorms fluorescens, ATCC948)中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶(CAT)转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于利用微生物菌株(ATCC948) —荧光假单胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶(LOD)及过氧化氢酶(CAT)转化 DL-乳酸制备丙酮酸。2.如权利要求1所述的转化DL-乳酸制备丙酮酸的方法，其详细操作步骤为(1)菌种选择选用微生物菌株(ATCC948) —荧光假单胞菌iPsendcmoims fluorescens)，采用以乳酸为唯一碳源的培养基进行培养，该菌株具有高乳酸氧化酶活力和过氧化氢酶活力；(2)斜面培养将荧光假单胞菌菌株接种于含有1.5-2.0%的琼脂糖并加有 1. 0-2. 0% DL-乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25-35°C培养20-30小时；(3)一级种子培养将步骤( 培养的菌株，无菌条件下用接种环接1 2环于50 IOOmL含有1. 0-2. 0% DL-乳酸钠的液体基本培养基(LLM)中，25_35°C条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得一级种子；(4)扩大培养以3-5%(体积比)接种量，接一级种子于500 mL含有1.0-2.0% DL-乳酸钠的LLM中，25-35°C条件下，在摇床上振荡培养20-30小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以3-5%(体积比)接种量，接二级种子于2L含有0. 1-0. 5%葡萄糖、 1. 0-2. 0% DL-乳酸钠的LLM中，25-35°C条件下，培养6-8小时补料，补料液为15-25%的乳酸钠溶液，补料速度为0. 2本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用来自荧光假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ，ＡＴＣＣ９４８）中的乳酸氧化酶（ＬＯＤ）及过氧化氢酶（ＣＡＴ）转化ＤＬ－乳酸制备丙酮酸的方法，其特征在于：利用微生物菌株（ＡＴＣＣ９４８）—荧光假单胞菌粗酶液中的乳酸氧化酶（ＬＯＤ）及过氧化氢酶（ＣＡＴ）转化ＤＬ－乳酸制备丙酮酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谷劲松，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：88