１，３－丙二醇氧化还原酶辅酶特异性改造及其应用，属于生物工程技术领域。其特征是通过理性设计改造１，３－丙二醇氧化还原酶辅酶特异性获得突变酶，通过构建含有上述突变酶基因序列的重组表达载体，并将该重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株，以及该重组菌株在制备１，３－丙二醇中的应用。本发明专利技术的效果和益处是同原始菌株相比，利用本发明专利技术提供的重组菌株进行发酵，１，３－丙二醇的产量提高１０～５０％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及1，3-丙二醇氧化还原酶辅酶特异性的理 性设计与改造，同时涉及一种含有上述突变酶基因序列的重组表达载体，以及 利用含有该载体的宿主细胞在发酵甘油生产1,3-丙二醇中的应用。
技术介绍
1,3-丙二醇(l，3-propanedio1，简称1，3-PD)是一种无色、无味的粘稠液体。作 为重要的化工原料，1,3-丙二醇可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以 及新型聚酯-聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚氨酯的单体。PTT是一种新型聚酯 材料，可用于地毯、工程塑料、膜及纺织业的服装材料等，而且PTT具有优异 的回弹性、染色性、抗污性、较好的抗紫外变色性能以及不易起静电、吸水较 少等特点，1998年被评为美国六石化新产品之一。1，3-丙二醇还可用于生产热塑 性聚氨酯和用作PVC的高分子型增塑剂。作为二元醇，它还能代替l,4-丁二醇 和新戊二醇作为中间体。研究发现，1，3-丙二醇的二醇官能团，使其用于聚氨酯 的生产具有很多潜力，如用于聚酯多元醇的生产和作为链增长剂。在医药合成 领域，1,3-丙二醇已得到应用，在该领域中一些新用途也正在开发。近年，以1，3-丙二醇作为有机合成原料己越来越受重视，如1，3-丙二醇经空气氧化可合成3-羟基丙酸和丙二酸，与尿素反应可合成环状碳酸酯。1，3-丙二醇被认为是本世纪 最具有广阔应用前景的化工原料。鉴于1,3-丙二醇的广泛市场前景，其生产方法多年来受到国内外大型企业和科研机构的广泛关注。几家世界著名的大化学工业公司，例如荷兰Shell公司， 德国Degussa公司相继投入规模化生产1,3-丙二醇，并加紧了应用研究和开发。 其生产1,3-丙二醇的方法主要是化学法合成。用化学方法合成1,3-丙二醇需要在 高温、高压及贵重催化剂才能实现，成本较高，设备投资大，技术难度高，产 品分离纯化困难，特别是催化剂的制备较难，且产生CO等污染环境的废气。随 着现代生物技术的发展，人们开始尝试用微生物发酵法生产1,3-丙二醇的研究。 微生物发酵法具有条件温和、操作简单、副产物少、绿色环保等优点，这方面 的研究成为当前国内外研究的热点。微生物发酵甘油生产l,3-丙二醇的菌种包括克雷伯氏菌属(A7AwW/a)、柠 檬酸菌属(C/fra6acter)、梭菌属(C/oWnWww)等。克雷伯氏杆菌(K/e^/e〃 ，emomk)具有较高的甘油耐受力，较高的转化率和l，3-丙二醇生产能力，因此 受到更多的关注。而且克雷伯氏杆菌属兼性菌，其生化特性与大肠杆菌非常相 近，这就为菌种的基因改良和利用基因工程构建新的菌种提供了便利。克雷伯 氏杆菌以甘油为底物厌氧发酵的代谢途径涉及氧化途径和还原途径两个平行的 路线。通过氧化途径，甘油被依赖NAD+的甘油脱氢酶(GDH)催化脱氢生成二羟 基丙酮(DHA)，然后进一步代谢为丙酮酸，生成能量ATP和还原当量NADH以及 乙酸、乙醇等副产物，并伴随着微生物细胞的生长；而通过还原途径，甘油则 被依赖辅酶Bi2的甘油脱水酶(GDHt)催化脱水生成3-羟基丙醛(3-HPA)，再进一步 由与NADH相连的1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)还原为产物l,3-丙二醇，同时消 耗了氧化途径上生成的过量的NADH。氧化途径和还原途径通过还原当量 NADVNADH相连接，使甘油歧化与细胞生长相耦联。近年来，已有许多公司和科研机构针对生物转化法生产1,3-丙二醇进行了研 发。生物转化法生产1,3丙二醇的一种常用策略是利用原始菌株，通过优化发酵工艺条件来提高1,3丙二醇的产量。如大连理工大学(中国专利ZL01117282.7) 采用微氧条件下发酵生产1，3-丙二醇并完成中试放大；清华大学(中国专利ZL 03121946=2;中国专利ZL 200510011917.2)采用外源添加维生素C、维生素E 或反丁烯二酸来促进1,3-丙二醇生产；东南大学(中国专利CN200810020203.1) 采用在发酵液中添加非离子表面活性剂的方法来改变细胞膜的通透性。通过优 化发酵工艺条件虽然可以在一定程度上提高1,3-丙二醇的产量，但由于受到原始 菌株自身的生产能力等诸多因素限制，1，3-丙二醇的发酵产量无法获得大幅度增 加。为了打破原始菌株自身生产能力的限制，人们逐渐转向另一种策略，即采 用重组菌株发酵生产1，3-丙二醇。在采用重组菌株方面，美国Dupont公司与世 界第二大工业酶生产商Genencor国际有限公司申请了以可发酵碳源为底物用基 因工程菌直接生产1，3-丙二醇的专利(US Patent 7067300; US Patent 6514733)。 国内各科研院所也积极开展重组菌株构建方面的研究。如江南大学(中国专利 CN 200610039670.X)构建了一株重组大肠杆菌；北京化工大学(中国专利CN 200710176065.1)在克雷伯氏杆菌中同时高表达甘油脱水酶和来自大肠杆菌的醇 氧化还原酶。在关键酶改造方面，上海理工大学(中国专利CN200710171758.1; 中国专利CN 200710171759.6)采用易错PCR技术获得了 1,3-丙二醇氧化还原 酶同工酶变体酶。然而，目前采用重组菌株生产1,3-丙二醇仍存在产物浓度低、 甘油转化率低、生产强度低等问题。研究发现当底物浓度较高时，菌体内3-HPA出现积累(Barbirato， R /., Appl. Environ. Microbiol., 1996， 62(4): 1448-1451)，这种积累会严重抑制菌体的 正常生长，同时也反映出此时菌体内1,3-丙—醇氧化还原酶的相对缺乏。但即使 在菌体内高表达1，3-丙二醇氧化还原酶仍无法得到预期的效果(Zheng, P. W /., Process Biochem. 2006， 41(10): 2160-2169)。分析菌体内甘油代谢途径发现，由于1，3-丙二醇氧化还原酶活性的发挥有赖于辅酶NADH，菌体内辅酶NADH的 量可能成为限制1，3-丙二醇氧化还原酶活性进而影响1，3-丙二醇生成的一个重要 因素。另一方面，考虑到菌体内磷酸戊糖途径产生大量的NADPH，如果能将 1，3-丙二醇氧化还原酶改造为既可以利用NADH又可以利用NADPH的突变酶， 并在这些微生物体内实现高效表达，这样不仅能够维系氧化途径与还原途径的 平衡，而且能够有效利用菌体内还原力，有利于1,3-丙二醇的浓度和生产强度的 提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种1，3-丙二醇氧化还原酶辅酶特异性改 造及其应用，提高1,3-丙二醇的产量。 本专利技术的技术方案如下 第一步提供了一种通过理性设计改造1,3-丙二醇氧化还原酶辅酶特异性的方法，改造后获得的突变酶既可以利用NADH，又可以利用NADPH作为还原力。在此方面的实施方案中，所述1,3-丙二醇氧化还原酶基因来自克雷伯氏菌属 (K/e^W/a)、柠檬酸菌属(C^raZwe;0或梭菌属(C7o^rWwm)，所使用的1,3-丙二醇氧化还原酶基因应该具有如SEQIDNO: 1 (见序列表)所示的序列，或 者是SEQIDNO: 1的简并性序列，或者是所编码的序列因取代、缺失、插入和 /或添加一个或几个氨基酸残基而与本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种１，３－丙二醇氧化还原酶辅酶特异性改造及其应用，其特征在于如下步骤： 第一步：所述１，３－丙二醇氧化还原酶基因来自克雷伯氏菌属、柠檬酸菌属或梭菌属，所使用的１，３－丙二醇氧化还原酶基因具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的序列，或者是ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：１的简并性序列，或者是所编码的序列因取代、缺失、插入和／或添加一个或几个氨基酸残基而与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所编码序列有所不同，但仍具有相同酶活性的酶的核苷酸序列； 所使用的１，３－丙二醇氧化还原酶突变酶具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２的序列，或者因取代、缺失、插入和／或添加一个或几个氨基酸残基而与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的序列有所不同，但仍具有相同酶活性的酶的氨基酸酸序列； 所使用的１，３－丙二醇氧化还原酶突变酶基因具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３的序列，或者是ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３的简并性序列，或者是所编码的序列因取代、缺失、插入和／或添加一个或几个氨基酸残基而与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所编码序列有所不同，但仍具有相同酶活性的酶的核苷酸序列； 第二步：所述启动子是组成型启动子或者可诱导型启动子，组成型启动子 选自蛋白激酶启动子、固氮启动子或二羟丙酮启动子，可诱导型启动子选自乳糖启动子、噬菌体启动子、乳糖和色氨酸的杂合启动子或色氨酸启动子； 所述重组载体的载体骨架选自ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ １８、ｐＥＴ系列或ｐＤＫ系列载体； 第三步：所述宿主细 胞选自克雷伯氏菌属、柠檬酸菌属或梭菌属； 第四步：发酵方式采用批式发酵、批式流加发酵或连续发酵；种子及发酵培养基中含有碳源、氮源、无机盐和维生素；发酵是在微生物培养过程中通入空气进行的有氧发酵、微氧发酵或者在微生物培养过程中通入氮气进行的 厌氧发酵；发酵接种量１～１２％，培养温度２０～５０℃，发酵时通气量为０．１～１．０ｖｖｍ，调节ｐＨ维持在５．０～９．０，搅拌转速为８０～３５０ｒｐｍ。...
【技术特征摘要】
1.一种1，3-丙二醇氧化还原酶辅酶特异性改造及其应用，其特征在于如下步骤第一步所述1，3-丙二醇氧化还原酶基因来自克雷伯氏菌属、柠檬酸菌属或梭菌属，所使用的1，3-丙二醇氧化还原酶基因具有SEQ ID NO1的序列，或者是SEQ ID NO1的简并性序列，或者是所编码的序列因取代、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸残基而与SEQ ID NO1所编码序列有所不同，但仍具有相同酶活性的酶的核苷酸序列；所使用的1，3-丙二醇氧化还原酶突变酶具有SEQ ID NO2的序列，或者因取代、缺失、插入和/或添加一个或几个氨基酸残基而与SEQ ID NO2的序列有所不同，但仍具有相同酶活性的酶的氨基酸酸序列；所使用的1，3-丙二醇氧化还原酶突变酶基因具有SEQ ID NO3的序列，或者是SEQ ID NO3的简并性序列，或者是所编码的序列因取代、缺失、插入和/或添加一个或...
【专利技术属性】
技术研发人员：修志龙，马成伟，张乐，戴建英，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：91[]
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