一种醛还原酶的重组表达及其在甘油生物转化为1,3-丙二醇中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种醛还原酶的重组表达及其在甘油生物转化为１，３－丙二醇中的应用，属于生物工程技术领域。其特征是通过一种含有上述醛还原酶基因序列的重组表达载体，将该酶表达到宿主细胞中，并应用于制备１，３－丙二醇。本发明专利技术的效果和益处是重组克雷伯氏菌（ｐＤＫ－ｙｑｈＤ）以甘油为底物，发酵３０ｈ后，测得发酵液中的１，３－丙二醇浓度比对照菌株提高１７．１％。本发明专利技术的效果和益处是：同原始菌株相比，利用本发明专利技术提供的重组菌株进行发酵，１，３－丙二醇的产量提高１０～５０％，为进一步构建以甘油为底物高产１，３－丙二醇的基因工程菌打下基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及到含有醛还原酶基因的重组表达载体， 以及用其转化的宿主细胞发酵甘油高产1,3-丙二醇的应用。
技术介绍
1，3-丙二醇(l,3-propanedio1，简称1，3-PD)是无色、无味的粘稠液体，是一种 重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚酯 ——聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)和聚氨酯的单体。PTT是一种新型聚酯材料， 可用于地毯、工程塑料、膜及纺织业的服装材料等，而且PTT具有优异的回弹 性、染色性、抗污性、较好的抗紫外变色性能以及不易起静电、吸水较少等特 点，1998年被评为美国六大石化新产品之一。1,3-丙二醇还可用于生产热塑性聚 氨酯和用作PVC的高分子型增塑剂。作为二元醇，它还能代替1,4-丁二醇和新 戊二醇作为中间体。美国Chem Systems公司研究发现，1，3-丙二醇的二醇官能 团，使其用于聚氨酯的生产具有很多潜力，如用于聚酯多元醇的生产和作为链 增长剂。在医药合成领域，1,3-丙二醇己得到应用，在该领域中一些新用途也正 在开发。近年，以1，3-丙二醇作为有机合成原料己越来越受重视，如1,3-丙二醇 经空气氧化可合成3-羟基丙酸和丙二酸，与尿素反应可合成环状碳酸酯。1,3-丙二醇被认为是本世纪最具有广阔应用前景的化工原料。鉴于1,3-丙二醇的广泛市场前景，其生产方法多年来受到国内外大型企业和 科研机构的广泛关注。几家世界著名的化学工业公司，例如荷兰Shell公司，德 国Degussa公司相继投入规模化生产1，3-丙二醇并加紧了应用研究和开发。其生 产1，3-丙二醇的方法主要是化学合成法。用化学法合成1，3-丙二醇需要在高温、 高压及使用贵重催化剂才能实现，成本较高，设备投资大，技术难度高，产品 分离纯化困难，特别是催化剂的制备较难，且产生CO等污染环境的废气。随着3现代生物技术的发展，人们开始尝试用微生物发酵法生产1,3-丙二醇的研究。微 生物发酵法具有条件温和、操作简单、副产物少、绿色环保等优点，这方面的 研究成为当前国内外研究的热点。微生物法发酵甘油生产l,3-丙二醇的菌种包括克雷伯氏菌属(《/eZm'e//a)、 柠檬酸菌属(a/ro6c^0、梭菌属(C7as的aMm)等。克雷伯氏菌(/C/eZ^W/a /7emo^)具有较高的甘油耐受力，较高的转化率和l,3-丙二醇生产能力，因 此受到更多的关注。而且克雷伯氏菌属兼性菌，其生化特性与大肠杆菌(￡. co//) 非常相近，这就为菌种的基因改良和利用基因工程构建新的菌种提供了便利。 克雷伯氏菌以甘油为底物厌氧发酵的代谢途径涉及氧化途径和还原途径两条平 行的路线。通过氧化途径，甘油被与NAD+相连的甘油脱氢酶(GDH)催化脱氢 生成二羟基丙酮(DHA)，然后进一步代谢为丙酮酸，生成能量ATP和还原当量 NAD+ZNADH以及乙酸、乙醇等副产物，并伴随着微生物细胞的生长；而通过还 原途径，甘油则被与维生素Bt2相关联的甘油脱水酶(GDHt)催化脱水生成3-羟基丙醛(3-HPA)，再进一步由与NADH相连的l,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR) 还原为产物l，3-丙二醇，同时消耗了氧化途径中生成的过量的还原型辅酶I (NADH)。氧化途径和还原途径通过还原当量NAD+ZNADH相连接，使甘油歧 化与细胞生长相偶联。近年来，已有许多公司和科研机构针对生物转化法生产1，3-丙二醇进行了研 发。生物转化法生产1,3-丙二醇的一种常用策略是利用原始菌株，通过优化发酵 工艺条件来提高1，3-丙二醇的产量。如大连理工大学采用微氧条件下发酵生产 1,3-丙二醇并完成中试放大(中国专利ZL01117282.7);清华大学采用外源添加 维生素C、维生素E或反丁烯二酸来促进1，3-丙二醇生产(中国专利ZL 03121946.2;中国专利ZL200510011917.2);东南大学采用在发酵液中添加非离 子表面活性剂的方法来改变细胞膜的通透性，从而提高1,3-丙二醇的产量(中国 专利CN 200810020203.1)。通过优化发酵工艺条件虽然可以在一定程度上提高 1,3-丙二醇的产量，但由于受到原始菌株自身的生产能力等诸多因素限制，1,3-丙二醇的发酵产量无法获得大幅度增加。为了打破原始菌株自身生产能力的限制，人们逐渐转向另一种策略，即采用重组菌株发酵生产1,3-丙二醇。在采用重组菌株方面，美国Dupont公司与世界第二大工业酶生产商Genencor国际有限公 司申请了以可发酵碳源为底物用基因工程菌直接生产1，3-丙二醇的专利(US Patent 7067300; US Patent 6514733)， 1，3-丙二醇最高产量可达到135 g/L。国内 各科研院所也积极开展重组菌株构建方面的研究，如江南大学构建了一株重组 大肠杆菌，该菌株在初始甘油浓度为50g/L，单批发酵成熟发酵液中1,3-丙二醇 的最终浓度可达到35 42 g/L (中国专利ZL200610039670.X)。北京化工大学 在克雷伯氏杆菌中同时高表达甘油脱水酶和来自大肠杆菌的醛还原酶，使1,3-丙二醇的产量得到提高(中国专利CN 200710176065.1)。在关键酶改造方面， 上海理工大学采用易错PCR技术获得了l,3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体酶(中 国专利CN 200710171758.1;中国专利CN 200710171759.6)。除Dupont公司采 用重组大肠杆菌生产1，3-丙二醇产量得到很大提升外，目前采用重组菌株生产 1,3-丙二醇仍存在产物浓度低、甘油转化率低、生产强度低等问题。研究发现在厌氧批式发酵中，当起始甘油浓度达到44.2 g/L时，3-羟基丙醛 在细胞中积累，导致细胞停止生长，甘油消耗停滞(Barbirato, F. W Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62(4): 1448-1451)。同时也反映出此时菌体内1，3-丙二醇 氧化还原酶的相对缺乏。但即使在菌体内高表达l,3-丙二醇氧化还原酶仍无法得 到预期的效果(Zheng, R a/.， Process Biochem. 2006， 41(10): 2160-2169)。 1,3-丙二醇氧化还原酶是一个双向酶，既能催化3-羟基丙醛转化为l，3-丙二醇，又能 将生成的l,3-丙二醇转化为3-羟基丙醛，这样对l,3-丙二醇的积累是不利的。而 克雷伯氏菌DSM2026 (德国国家微生物菌种保藏中心，编号2026)中的醛还原 酶，具有逆反应为零的性质，能将3-羟基丙醛转化为l,3-丙二醇，从而解除3-羟 基丙醛的毒害作用，有利于l，3-丙二醇的合成。由生产l,3-丙二醇的微生物甘油代谢途径可见，菌体内NADH的量是限制 1,3-丙二醇生成的一个重要因素。考虑到菌体内存在大量的NADPH，而某些微 生物，比如克雷伯氏菌属(尺/e^W/a)、柠檬酸菌属(C浙o6ac欣)、梭菌属 (C/o愤W,)等中的菌种，其中的1，3-丙二醇氧化还原酶不能有效利用NADPH合成l，3-丙二醇。而醛还原酶是天然的可以利用NADPH作为辅酶的，同时我们 克隆得到的醛还原酶既可以利用NADPH，又可以利用NADH，从而加强本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种醛还原酶的重组表达及其在甘油生物转化为１，３－丙二醇中的应用，其特征在于如下步骤：　第一步：所述的醛还原酶，其基因来自于克雷伯氏菌属、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、痢疾杆菌或沙门氏菌属，具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的氨基酸序列或者因取 代、缺失、插入和／或添加一或几个氨基酸残基而与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的序列有所不同，但仍具有相同酶活性的酶的氨基酸序列；　醛还原酶的基因具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的核苷酸序列，或者ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的简并性序列，或者因 编码的取代、缺失、插入和／或添加一或几个氨基酸残基而与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所编码序列有所不同，但仍具有相同酶活性的酶的核苷酸序列；　第二步：所述的重组表达载体，其特征是含有一个或多个拷贝的在启动子控制下的上述醛还原酶基因序列；组 成型启动子选自蛋白激酶启动子、固氮启动子或二羟丙酮启动子，可诱导型启动子选自乳糖启动子、噬菌体启动子、乳糖和色氨酸的杂合启动子或色氨酸启动子；其载体的骨架选自ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系列、ｐＥＴ系列或ｐＤＫ系列载体；　第三步：所述的宿主细 胞，其特征是选自克雷伯氏菌属、柠檬酸菌属或梭菌属等；　第四步：发酵方式采用批式发酵、批式流加发酵或连续发酵；发酵是在微生物培养过程中通入空气进行的有氧发酵、微氧发酵或者在微生物培养过程中通入氮气进行的厌氧发酵；种子及发酵培养基中含有碳 源、氮源、无机盐和维生素；发酵接种量１～１２％，培养温度２０～５０℃，发酵时通气量为０．１～１．０ｖｖｍ，调节ｐＨ维持在５．０～９．０，搅拌转速为８０～３５０ｒｐｍ，培养时间１０～５０ｈ。...

【技术特征摘要】
1、一种醛还原酶的重组表达及其在甘油生物转化为1，3-丙二醇中的应用，其特征在于如下步骤第一步所述的醛还原酶，其基因来自于克雷伯氏菌属、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、痢疾杆菌或沙门氏菌属，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列或者因取代、缺失、插入和/或添加一或几个氨基酸残基而与SEQ ID NO1的序列有所不同，但仍具有相同酶活性的酶的氨基酸序列；醛还原酶的基因具有SEQ ID NO2的核苷酸序列，或者SEQ ID NO2的简并性序列，或者因编码的取代、缺失、插入和/或添加一或几个氨基酸残基而与SEQ ID NO2所编码序列有所不同，但仍具有相同酶活性的酶的核苷酸序列；第二步所述的重组表达载体，其特征是含有一个或多个拷贝的在启动子控制下的上述醛还原酶基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：修志龙，张乐，马成伟，戴建英，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]