一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物，其特征在于，该不对称PCR扩增引物为一对特异性扩增登革病毒NS5基因的10589‑10754bp区域的引物，其序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示。本发明专利技术还涉及检测登革病毒的方法，该方法采用胶体金检测试纸条检测所述的引物扩增出的单链DNA，不仅能快速检测登革病毒的4种血清型，而且具有良好的诊断准确性和稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物及其应用
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及包含核酸、酶或微生物的测定或检验方法的检测试剂。
技术介绍
登革病毒在分类上属黄病毒科、黄病毒属的病毒，是流行范围最广、发病人数最多、危害性较大的一种虫媒传播的病毒，其主要的传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊。登革病毒感染是一种蚊媒传播疾病，多在热带与亚热带地区流行暴发，根据临床表现严重程度的不同，可分为登革热(DF)、登革出血热(DHF)、登革休克综合征(dengueshocksyndrome，DSS)三种临床类型，登革热主要以高热、头痛、肌肉和关节痛为主，可伴有皮疹、淋巴腺肿和白血球减少，此类疾病传播迅速，可引起较大规模的流行，病死率较低，一般将这种病型称为古典型登革热。而登革出血热是以高热、出血、休克、和高病死率为特征，是较为严重的一种临床类型，伴有休克综合征倾向的称为登革出血热、登革休克综合征。据世界卫生组织统计，全球每年有50万人感染登革热，死亡约2.5万人，大约有25-30亿人口处于登革病毒的威胁之下。2014年广州省发生大规模的暴发流行，据报道病例总数累计报告登革热病例45171例，累计报告死亡病例6例。2015年在云南的西双版纳，广东潮州，台湾地区也发生了登革热流行，最为严重的要数台湾，截止到2015年11月，累积病例数就超过了3万，累计报告死亡病例141例。目前，国内外对登革病毒的诊断方法，主要还是依靠病毒培养、血清学试验、常规的PCR检测及实时荧光定量PCR，其中，血清学试验、组织培养具有灵敏度低、免疫交叉反应以及周期长等缺点；而常规PCR也存在容易污染、耗时长的不足，实时荧光PCR技术因为其仪器设备昂贵，不利于一般检测机构的检测及大样本量检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物，该引物用于登革病毒的检测具有特异性和敏感性好的优点。本专利技术解决上述问题的技术方案如下：一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物，其特征在于，该不对称PCR扩增引物为一对特异性扩增登革病毒NS5基因的10589-10754bp区域的引物，其序列为：非限制性引物序列为：5’-GGTTAGAGGAGACCCCTCCC-3’(SEQNO.1)，限制性引物序列为：5’-GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT-3’(SEQNO.2)；本专利技术还提供一种使用上述不对称PCR扩增引物检测登革病毒的方法，该方法包括以下步骤：(1)取寨卡病毒，先提取其核酸，再以所到的核酸为模板进行RT-PCR扩增，获得逆转录产物；然后，(2)以逆转录产物为模板，采用上述不对称PCR扩增引物扩增出登革病毒NS5基因的10589-10754bp区域的单链DNA(ssDNA)；(3)根据所述的单链DNA的序列设计出胶体金检测试纸条，该胶体金检测试纸条包括PVC支撑片、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫五部分，其中，所述的结合垫上包被有胶体金标记的如下检测探针：5’-AGACCAGAGATCCTGCTGTCTCAAAAAAAAAA–巯基-3’(SEQNO.3)；所述的聚酯纤维素膜上设有检测线和控制线，其中，所述的检测线的位置喷涂有如下捕获探针：5’–生物素-AAACAGCATATTGACGCTGGGA-3’(SEQNO.4)；所述的控制线的位置喷涂有如下捕获探针：5’-TTTTTGAGACAGCAGGATCTCTGGTCT–生物素-3’(SEQNO.5)；(4)将步骤(2)所得到的单链DNA滴于步骤(3)所述的样品垫上，补加适量4×SSC杂交缓冲液，使刚好完全浸湿结合垫；约5min后采用4×SSC杂交缓冲液清洗所述的胶体金检测试纸条以降低背景；10min内观察检测线和控制线是否显色，按以下方法进行定性判断：若检测线与控制线同时显色，结果为阳性；若检测线不显色，而控制线显色，则结果为阴性；若控制线不显色说明试纸条无效。登革病毒NS5蛋白10589-10754bp编码区的165bp的区域，具有4种血清型登革病毒共有的保守序列而其他病毒不具有的特异序列，在这个区域可以设计引物和探针针对登革病毒进行特异性检测。更进一步地，本专利技术将胶体金技术与杂交介导的探针捕获检测技术结合在一起形成胶体金检测试纸条可以在十分钟内对扩增的产物进行可视化的检测，可准确、特异、灵敏、稳定检测登革病毒NS5基因片段所扩增的单链DNA。附图说明图1为本专利技术所述单链核酸片段扩增原理图。图2为本专利技术所述胶体金检测试纸条的特异性效果图。图3为本专利技术所述胶体金检测试纸条的灵敏度效果图。图4和5是本专利技术所述胶体金检测试纸条的结构示意图，其中图4为主视图，图5为俯视图。其中：1-PVC支撑片，2-样品垫，3-结合垫，铺有胶体金和检测探针，4-硝酸纤维素膜，5-吸水垫，6-captureprobeT和链霉亲和素，喷涂于硝酸纤维素膜,形成检测线T，7-captureprobeC和链霉亲和素,喷涂于硝酸纤维素膜，形成质控线C。具体实施方式实施例1(引物的设计与合成)分别从GenBank中获取四种不同血清型的登革热病毒NS5基因全序列进行分析和实验研究，最后选定登革病毒NS5蛋白10589-10754bp编码区的165bp的基因片为目标区域，采用primer5软件设计出不对称PCR扩增引物，其中非限制性引物如SEQNO.1所示，限制性引物如SEQNO.2所示。然后，委托北京六合华大生物科技有限公司公司合成。实施例2(胶体金检测试纸条的制备)根据采用实施例1所述引物不对称扩增出单链DNA的序列设计出胶体金检测试纸条，该试纸条的结构如图4和5所示。参见图4和5，所述的胶体金检测试纸条(简称试纸条)包括条状的PVC支撑片7，该支撑片7的上表面自一头至另一头依次设有样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4。其中，所述的硝酸纤维素膜3上分布检测线5和控制线6，其中检测线5是在硝酸纤维素膜3上喷涂如SEQNO.4所示的捕获探针形成，控制线6是在硝酸纤维素膜3上喷涂如SEQNO.5所示的捕获探针形成；所述的结合垫2上包被有胶体金标记的如SEQNO.3所示的检测探针。上述试纸条的具体制备方法如下：1、胶体金的制备(1)制备王水：HCl：HNO3＝3：1于烧杯中。(王水必须现用现配，不能储存在密闭容器中，以免引起爆炸。)此步操作应在通风橱中进行。(2)取200ml双颈圆底烧瓶，磁力搅拌棒，塞子(橡皮塞)和冷凝管放入王水中至少浸泡15min，然后依次用大量的去离子水和双蒸水冲洗这些玻璃器皿，100℃以上干燥。(3)配制100ml1mMHAuCl4：在双颈瓶中加入98ml双蒸水和2ml50mMHAuCl4，或称取0.03938gHAuCl4溶于100ml双蒸水中。(4)在双颈瓶的两个口上分别接上冷凝管和塞子，加入磁力搅拌器并加热，此时应确保冷凝管中已通入流动水。(5)当观察到反应液充分沸腾，冷凝管中的冷凝水开始回流时(1drop/s)，取出塞子，快速加入10ml38.8mM柠檬酸钠，并重新塞上塞子。这是溶液的颜色会发生快速的变化，其顺序应为：淡黄色→无色→黑色→紫色→深红色。继续加热回流15～20min。(6)停止加热，但持续搅拌，使反应系统自然冷却至室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物，其特征在于，该不对称PCR扩增引物为一对特异性扩增登革病毒NS5基因的10589‑10754bp区域的引物，其序列为：非限制性引物序列为：5’‑GGTTAGAGGAGACCCCTCCC‑3’(SEQ NO.1)，限制性引物序列为：5’‑GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT‑3’(SEQ NO.2)；

【技术特征摘要】
1.一种登革病毒NS5基因片段的不对称PCR扩增引物，其特征在于，该不对称PCR扩增引物为一对特异性扩增登革病毒NS5基因的10589-10754bp区域的引物，其序列为：非限制性引物序列为：5’-GGTTAGAGGAGACCCCTCCC-3’(SEQNO.1)，限制性引物序列为：5’-GAGACAGCAGGATCTCTGGTCT-3’(SEQNO.2)；2.一种检测登革病毒的方法，该方法包括以下步骤：(1)取寨卡病毒，先提取其核酸，再以所到的核酸为模板进行RT-PCR扩增，获得逆转录产物；然后，(2)以逆转录产物为模板，采用权利要求1所述不对称PCR扩增引物扩增出登革病毒NS5基因的10589-10754bp区域的单链DNA(ssDNA)；(3)根据所述的单链DNA的序列设计出胶体金检测试纸条，该胶体金检测试纸条包括PVC支撑片、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫五部分，其中，所述的结合垫...

【专利技术属性】
技术研发人员：李耿，张威，陈思泰，吴建国，赖小平，
申请(专利权)人：广州中医药大学，
类型：发明
国别省市：广东,44