基于POCKIT Micro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病的检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病的检测试剂盒及应用，该试剂盒包含DNA提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；荧光定量PCR反应液包括牛羊细粒棘球蚴病上游引物，牛羊细粒棘球蚴病下游引物，牛羊细粒棘球蚴病探针，Taq酶，预混buffer和去离子水；牛羊细粒棘球蚴病上游引物、牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列和牛羊细粒棘球蚴病探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本试剂盒异性强、灵敏度高、无污染、无需电泳，可在现场快速检测。

【技术实现步骤摘要】
基于POCKITMicro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病的检测试剂盒及应用
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种基于POCKITMicro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病的检测试剂盒及应用。
技术介绍
细粒棘球蚴病蚴病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，在我国四川、青海、甘肃、宁夏、新疆等地区普遍存在，其中牦牛、羊是其主要的中间宿主，牛羊感染细粒棘球蚴后一方面严重影响其生长性能，另一方面感染细粒棘球蚴的牛羊内脏不经处理被犬吞食是造成该病流行的关键环节。目前基层对牛羊脏器是否感染细粒棘球蚴主要靠眼观手摸，具有很大的局限性，对于较小的包囊，或者其它寄生虫造成的疑似包囊(比如肝片吸虫、细颈囊尾蚴等)无法准确判定。而实验室检测主要是PCR方法，需要专门的仪器(PCR仪，离心机等)，基层检疫部门往往缺乏相应的仪器和技术人员，因此对牛羊内脏是否感染细粒棘球蚴的现场快速检测方法的建立就迫在眉睫。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种基于POCKITMicro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病的检测试剂盒及应用，本专利技术是基于POCKITMicro平台的荧光PCR，操作简单、敏感性高、特异性强，可以现场对牛羊细粒棘球蚴病的检测提供科学依据，对保障人畜健康、提高公共卫生安全水平具有重要意义。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种基于POCKITMicro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病检测的引物和探针，所述引物和探针包括：牛羊细粒棘球蚴病上游引物、牛羊细粒棘球蚴病下游引物和牛羊细粒棘球蚴病探针，其中，所述牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQIDNO.3所示。本专利技术还公开了一种上述的引物和探针在制备牛羊细粒棘球蚴病检测试剂盒方面的应用。本专利技术还公开了一种基于POCKITMicro荧光PCR的牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒，该试剂盒包括DNA模板、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；所述荧光定量PCR反应液包括牛羊细粒棘球蚴病上游引物3.5μL，牛羊细粒棘球蚴病下游引物3.5μL，牛羊细粒棘球蚴病探针1.5μL，Taq酶1.5μL，预混buffer25μL，去离子水14μL，总量为49μL，DNA模板与荧光定量PCR反应液的总量为50μL；所述牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQIDNO.3所示。进一步地，Taq酶的终浓度为5U·μL-1，牛羊细粒棘球蚴病上游引物和牛羊细粒棘球蚴病下游引物的终浓度均为400nM，牛羊细粒棘球蚴病探针的终浓度为250nM。进一步地，阳性对照品为：含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，所述ND1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述阴性对照品为：无ND1基因片段的pEASY-T1空载体。进一步地，含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，由以下方法制备得到：1)利用牛羊细粒棘球蚴病上游引物和牛羊细粒棘球蚴病下游引物，以细粒棘球绦虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因的PCR扩增产物；2)将PCR扩增产物克隆到pEASY-T1载体上，构建含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒；3)抽提质粒，定量并稀释至103拷贝/μl，制备得到含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，即为阳性对照品。本专利技术还公开了一种上述的试剂盒定性检测牛羊细粒棘球蚴病的方法，包括以下步骤：a)采用PetNAD核酸快速提取试剂盒从待检测的标本中提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为1.5ng/μl，制备得到DNA提取液；b)以提取得到的DNA作为模板，加入到装有荧光定量PCR反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入等体积的阳性对照模板和阴性对照模板，将PCR管放置到POCKITMicro荧光PCR仪中进行检测，42分钟以后判读结果。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术提供了一种牛羊细粒棘球蚴病的荧光PCR检测试剂盒，其优点是异性强、灵敏度高、无污染、无需电泳，可在现场快速检测。2)本专利技术能快速、准确地检测出被检样本中的细粒棘球绦虫DNA，也可用于牛羊细粒棘球蚴病感染的分子流行病学调查。3)本专利技术的模板DNA制备步骤简单费用低，操作简单，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。4)本专利技术是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术牛羊细粒棘球蚴病阳性样本灵敏度检测结果；其中，1：105；2：104；3：103；4：102；图2是本专利技术中所用的临床样本核酸快速提取方法概览。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。本专利技术实施例中通用基因组提取试剂盒(UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0)为宝生物工程(大连)有限公司产品；PetNAD核酸快速提取试剂盒，POCKITMicro仪器(厦门金瑞鸿捷公司)；引物、探针设计与合成均由六合华大公司完成。本专利技术PCR特异性检测中所用的细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、肝片吸虫、前后盘吸虫、羊泡状带绦虫和日本血吸虫基因组DNA均由本实验室保存。实施例1基于POCKITMicro荧光PCR的牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒一种检测牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒，包括以下组分：(1)DNA模板：采用PetNAD核酸快速提取试剂盒从待检测的标本中提取的DNA；(2)荧光定量PCR反应液：牛羊细粒棘球蚴病上游引物3.5μL(终浓度400nM)，牛羊细粒棘球蚴病下游引物3.5μL(终浓度400nM)，牛羊细粒棘球蚴病探针1.5μL(终浓度250nM)，Taq酶1.5μL(终浓度5U·μL-1)，预混buffer25μL，去离子水14μL，总量为49μL，DNA模板与荧光定量PCR反应液的总量为50μL；牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQIDNO.3所示，具体的核苷酸序列如表1所示。(3)阳性对照品：含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，所述ND1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；阳性对照品通过以下方式制备得到：采用牛羊细粒棘球蚴病上游引物和牛羊细粒棘球蚴病下游引物PCR扩增细粒棘球绦虫DNA，扩增出的ND1基因部分序列(SEQIDNO.4)克隆到pEASY-T1(全式金公司)，转化后进行菌落PCR鉴定，阳性菌落培养后提取质粒进行测序。测序结果正确质粒采用NanoDrop200本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：牛羊细粒棘球蚴病上游引物、牛羊细粒棘球蚴病下游引物和牛羊细粒棘球蚴病探针，其中，所述牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于POCKITMicro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：牛羊细粒棘球蚴病上游引物、牛羊细粒棘球蚴病下游引物和牛羊细粒棘球蚴病探针，其中，所述牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQIDNO.3所示。2.权利要求1所述的引物和探针在制备牛羊细粒棘球蚴病检测试剂盒方面的应用。3.一种基于POCKITMicro荧光PCR的牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括DNA模板、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；所述荧光定量PCR反应液包括牛羊细粒棘球蚴病上游引物3.5μL，牛羊细粒棘球蚴病下游引物3.5μL，牛羊细粒棘球蚴病探针1.5μL，Taq酶1.5μL，预混buffer25μL，去离子水14μL，总量为49μL，DNA模板与荧光定量PCR反应液的总量为50μL；所述牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求3所述的基于POCKITMicro荧光PCR的牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒，其特征在于，Taq酶的终浓度为5U·μL-1，牛羊细粒棘球蚴病上游引物和牛羊细粒棘球蚴病下游引物的终浓度均为400nM，牛羊细粒棘球蚴病探针的终浓度为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝力力，汤承，岳华，黄建德，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川,51