本发明专利技术公开了一种黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法，Cyp24a1序列的全长为2180bp，编码506个氨基酸。黄颡鱼Cyp24a1蛋白的分子式为C2602H4112N704O740S26，分子量大小为57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。对黄颡鱼Cyp24a1蛋白结构和功能预测分析,Cyp24a1蛋白没有信号肽序列，并且也没有跨膜结构域。在NCBI上比对黄颡鱼Cyp24a1蛋白发现与斑点叉尾鮰和斑马鱼的同源性分别达到94％和74％。Cyp24a1基因在肝脏中表达最高，在肌肉和肠中微量表达。本发明专利技术利用RACE技术填补了该基因在黄颡鱼上的空白，为进一步研究该基因在鱼类上的功能奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及基因工程领域，具体地指一种黄顯鱼切P24al基因及其获得全长序列 的方法。
技术介绍
维生素 D属于固醇类衍生物，具有抗何僕病的作用，是动物必需的一种维生素。鱼 体不能合成维生素 D而必须由食物供给。由于鱼体对维生素化的利用率高于维生素化，所W 维生素化是鱼体中维生素 D的主要胆存形式。维生素化经鱼体的肠的吸收后，被乳糜微粒经 血液运送至肝脏。在肝脏中，维生素化在25位径基化形成25-径基维生素化d25 (0H)D3随后在25-径基维生素〇3-1α-径化酶(CYP24A1)的催化下转变为具有生物活性的Ια, 25-二径维生素〇3。[000引一些体内研究已经表明，维生素化最活跃的代谢物1α，25(0Η)2化可W减弱上皮细 胞的增殖作用、促进大肠癌细胞的分化和调亡，并且还具有降低肿瘤浸润程度、抑制肿瘤细 胞转移和远处迁移等一系列的抗癌作用。切p24al基因编码抑制维生素化代谢活化的酶25- 径基维生素03-24-径化酶(CYP24A1)，该酶能将1α，25(ΟΗ)203转换成失活形式的维生素03- 23-簇酸，减少化，25(0Η)2化的生成，降低其发挥生物学功能。然而，切p24al基因在鱼类上的 研究还较为缺乏。
技术实现思路
本专利技术的目的提供了一种黄顯鱼切p24al基因及其获得全长序列的方法。黄顯鱼 切p24al基因填补了该基因在黄顯鱼上的空白，为进一步研究黄顯鱼的该基因奠定了分子 基础。[000引为实现上述目的，本专利技术提供的一种黄顯鱼切p24al蛋白，所述黄顯鱼切p24al的 氨基酸序列为： (1)由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (2)与序列SEQ ID No.3限定的氨基酸序列同源性在90~100%编码相同功能蛋白 质的氨基酸序列； (3)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中密码子的第Ξ个碱基替换的一个或多个氨 基酸且具有同等活性的由（1)衍生的蛋白。 此外，应当理解，鉴于密码子兼并性及物种具有密码子偏好性的特点，本领域技术 人员，可W根据需要使用适合特定物种表达的密码子。 进一步地，所述黄顯鱼切p24a 1蛋白的分子式为C2602也mN704〇74〇S26，分子量大小为 57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。 编码蛋白的黄顯鱼切P24al基因的开放阅读框0RF，所述开放阅读框0RF的序列为 沈Q ID No. 1所示。 包含所述0RF的黄顯鱼切p24al基因全长序列，其特征在于:所述的黄顯鱼切p24al 基因全长序列为SEQ ID No.2所示。 获取黄顯鱼Cyp24al基因的全长序列的方法，包括w下步骤： 1)肝脏组织总RNA的提取； 2)cDNA第一链的合成； 3)Cyp24al核屯、片段的PCR扩增； 4)RACE-PCR 扩增； 5)RACE片段的分离与回收； 6)连接和转化； 7)将阳性克隆菌液送出测序； 8)Cyp24al的生物信息学分析；即得到黄顯鱼Cyp24al基因的全长序列。 进一步地，具体包括W下步骤： 1)肝脏组织总RNA的提取 总RNA提取过程严格按照无菌操作的要求进行，具体包括W下步骤： (1)从-80°C冰箱中取出lOOmg的肝脏组织，放入用高溫灭菌处理过的研鉢中，加入 液氮并磨成粉末； (2)向2mL的离屯、管中加入ImL预冷的RNAiso Plus裂解液，然后迅速把组织粉末加 入到离屯、管中，剧烈震荡，使其充分溶解，室溫静置5min; (3) 4°C条件下12000 X g离屯、5min，小屯、吸取上清液，移入新的1.5mL离屯、管中； (4)吸取0.2mL氯仿加入离屯、管中，盖紧离屯、管盖，用手剧烈震荡15s，混合至溶液 乳化呈白色，在室溫静置5min; (5)4°C条件下12000Xg离屯、15min，吸取上清液并转移到新的1.5mL离屯、管中； (6)向上清液中加入等体积的异丙醇，盖紧离屯、管盖，上下颠倒离屯、管使其充分地 混匀，在室溫静置lOmin; (7)4°C条件下12000Xg离屯、lOmin，在离屯、管底部可见胶状RNA沉淀； (8)小屯、弃去上清，沿着离屯、管壁缓慢地加入75%的乙醇ImL，轻轻上下颠倒洗涂 离屯、管管壁； (9)4°C条件下7500Xg离屯、5min后小屯、弃去上清； (10)打开离屯、管盖，室溫干燥沉淀3~5min，沉淀干燥后，加入适量的RNase-free 水溶解沉淀；[003引（11)用1.2 %的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余的总RNA放入-80°c冰箱 中保存； 2)cDNA第一链的合成 (1)在冰上配制DNA清除反应体系，如下：[003引 (2)4°C 条件下反应 2min; (3)在冰上配制反转录反应体系，如下： (4)在 PCR 仪器上 37°(315111111，85°〇53，在-20°(3冰箱中保存； 3)Cyp24al核屯、片段的PCR扩增 根据转录组的数据设计引物对[004引 Cyp24al-F：CGAGGTGCTGAAGAAGAAGT； Cyp24al-R：CTGGCTCATAATCTGTTGCTAC； PCR扩增的反应条件为：[004引 95°C3min ; 95°C30s，58°C30s，72°C2min，35个循环；72°C5分钟；PCR产物连入 PMD19-T载体中，转化E. coli D册α，涂布含氨卞青霉素的LB筛选平板，挑选若干个阳性克隆 进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，对PCR阳性克隆产物进行测序； 4)RACE-PCR 扩增 4.1RACE 引物设计 根据已获得Cyp24al核屯、序列分别设计RACE的巣式引物； 5'RACE 引物 Cyp24a1-GSP1：GGCACCACTTCTCTGATCTCCTT Cyp24al-NGSP1：CAGACTCTTGTGGAGACTTACTGGAG 3'RACE 引物 Cyp24al-GSP2：GGGCTCCTTGCTTGCTGGAGGCACTGT Cyp24al-NGSP2：GTGGTGCCTCCTGGACAGGATCCATGCG 4.2RACE-Ready cDNA准备 (1)在冰上分别配制5'-和3'-RACE-Ready cDNA反应液 (2)混匀试剂，瞬时离屯、，然后在PCR仪器解育，反应条件为72°C3min，42°C2min，冷 却后用HOOOXg离屯、10s; (3)在5'-和3'-RACE-Ready cDNA反应液中都加入下列试剂 (4)混匀试剂，瞬时离屯、;然后在PCR仪器中进行反转录反应，[006引反应条件为42°090111111，70°(310111111终止反应，用了6缓冲液稀释第一链反应物，并 在-20°C中保存； 4.3RACE-PCR 扩增 (l)RACE-PCR反应液的配制[006 引 (2)混匀试剂，瞬时离屯、； 按照如下条件进行叮 ouchdown" PCR: 94°C3min; 94°C30s，72°C3min，反应 5 个循环； 94°C30s，70°C30s，70°C3min，反应 5 个循环；94°C30s，68°C30s，70°C3min，反应 25 个循环；最 后 72°C 延伸 lOmin;本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种黄颡鱼Cyp24a1蛋白，其特征在于：所述黄颡鱼Cyp24a1的氨基酸序列为：(1)由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(2)与序列SEQ ID No.3限定的氨基酸序列同源性在90～100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；(3)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中密码子的第三个碱基替换的一个或多个氨基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王春芳，陈沛，何绪刚，谢从新，李大鹏，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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