本发明专利技术提供一种用于HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT试剂，它由用于扩增的6对组特异性引物和用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物组成；本发明专利技术还提供应用上述试剂的HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT方法，本发明专利技术所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，能成功解决HLA-DQB1位点的准确分型鉴定问题，有利于提高造血干细胞移植供受者HLA配型的准确性，从而选择更合适的移植供者，降低移植过程中的排斥反应，这对于进一步提高器官移植的成功率和生存率具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于HLA-DQB1基因分型的分子生物学检测方法，本专利技术还涉及该方法所应用的试剂和有关实验参数。
技术介绍
人类白细胞抗原（HLA）基因位于第6号染色体短臂21.3区域，是调控人体特异性免疫应答的主要基因系统，是目前所知的最富多态性的遗传系统。HLA抗原与同种器官移植的排斥反应密切相关，器官移植术后移植物能否存活很大程度上取决于供者与受者之间HLA型别是否相合。准确的HLA分型对选择合适的供者、降低移植物抗宿主病（GVHD）的发生率、提高移植物的存活率均有重要意义。HLA-DQB1属于经典的HLA-II类基因，在免疫应答中起重要作用，现在HLA-DQB1的分型已被大多数免疫遗传实验室作为常规检测用于移植供受者配对选择。HLA-DQB1有6个外显子，目前常规检测主要为第2和第3外显子的多态性。HLA-DQB1具有高度遗传多态性，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)在内含子和外显子区域均有丰富的分布，如第1内含子中平均每7个核苷酸即存在1个SNP位点，在第2和第3外显子平均每6个核苷酸有1个SNP位点，并且不同组特异性等位基因SNP位点不同。熟悉HLA-DQB1基因这些特点，对于分析HLA-DQB1基因序列确定等位基因型有一定的帮助。HLA测序分型为国际通用的组织配型高分辨检测技术, 基因测序分型技术的关键之一在于引物设计和PCR扩增。由于HLA-DQB1每一组等位基因在内含子和外显子均存在共享序列，为同时检测多组DQB1等位基因多态性，在试剂引物中可能含有多对扩增引物。在PCR同时扩增多对引物时由于存在竞争作用，某些等位基因会出现优势扩增现象。国外学者已报道DQB1基因在DQB1*02和DQB*03、DQBI*04等杂合情况下容易导致等位基因漏检。国内也有研究报道DQB1*06与DQB1*02杂合时，DQB*06等位基因优先扩增，DQB1*03与DQB1*02杂合时，DQB1*03等位基因优先扩增，从而导致DQB1*02等位基因漏检。我们在前期研究中也发现现有的商用试剂盒虽然可以同步检测HLA-DQB1的第2和3号外显子，但是也存在类似的等位基因漏检情况。因此，现有的方法存在一定缺陷，建立一种针对HLA-DQB1单一等位基因的PCR-SBT方法可以保证不同等位基因的有效扩增，对于提供准确的HLA-DQB1分型结果有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT试剂，以克服现有基因分型技术中的上述不足。为此，本专利技术采用以下技术方案：它由用于扩增的6对组特异性引物和用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物组成；所述用于扩增的引物为：(1) 扩增HLA-DQB1*02 组的特异性引物DQB1*02F：5'-CTCGTCATTCCCTTGAACTG-3'DQB1*02R：5'-AACCACCGGACTTTGATCTG-3'，(2) 扩增HLA-DQB1*03:01组的特异性引物DQB1*0301F：5'-TCAAAAGCTTGTGCTCTTTCAG-3'DQB1*0301R：5'-CAGTCCCTCCGAGCTATCAG-3'，(3) 扩增HLA-DQB1*03组（除DQB1*03:01外）和DQB1*04组的特异性引物DQB1*04F：5'-GATGAGGTGAGCACAGTCGG-3'DQB1*04R：5'-CTCCGAGCTATCAGGACTGG-3'，(4) 扩增HLA-DQB1*05 组的特异性引物DQB1*05F：5'-ACAGCAGGATTTGTCATTTCA-3'DQB1*05R：5'-GTCCTGTCTCCTCGCACTTC-3'，(5)扩增HLA-DQB1*06:01 组的特异性引物DQB1*0601F：5'-GGAAATACAAGGCAGCAATGA-3'DQB1*0601R：5'-CCTGCTGAGGAGCTGAAGTC-3'，(6) 扩增HLA-DQB1*06组(除DQB1*06:01外)的特异性引物DQB1*0602F：5'-CAAGACTGCCTGGACTTAGG-3'DQB1*0602R：5'-AGGACTGGGATTCAGAGCAA-3'；所述用于测序的4条寡核苷酸测序引物序列如下： DQB1-2F：5'-GGCCSGTGATTCCYCGCAG-3' DQB1-2R：5'-GGKCRACSMCGCTCACCTC-3' DQB1-3F：5'-CTTTYCCTGTCTGTTACTGC-3'DQB1-3R：5'-GGCCCAYARTAACAGAAACTC-3'。本专利技术还提供一种HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT方法，它对HLA-DQB1基因进行分型，包括以下步骤：（1）制备人基因组DNA；（2）提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中HLA-DQB1不同等位基因型序列；（3）将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；（4）提供测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；（5）将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；（6）将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定HLA-DQB1等位基因型。所述步骤（2）中的扩增引物为上述6对组特异性引物，所述步骤（4）中的测序引物为上述4条寡核苷酸测序引物。所述步骤（3）中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。本专利技术中引物设计是PCR扩增的关键，有关引物设计的方法和软件均可从英特网上免费获得。本专利技术所设计的寡核苷酸引物是根据IMGT/HLA数据库（ http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）中HLA-DQB1位点基因序列中包括多态性位点在内的连续寡核苷酸序列而获得的。所有引物的设计均避开目前已知的突变位点或采用简并引物方法，以免因位点的漏检而导致分型错误。本专利技术中6对寡核苷酸扩增引物分别针对HLA-DQB1位点不同等位基因组的共有序列设计，每对扩增引物只特异性扩增一组等位基因第2和第3外显子，避免了其他组等位基因的干扰。测序引物选择HLA-DQB1基因的保守区域设计，4条共同的测序引物可对不同组等位基因的扩增片段进行双向测序，保证清晰准确检测第2和第3外显子的全部序列，从而将标本进行精确的分型。本专利技术在明确HLA-DQB1位点组特异性的基础上，选择不同的组特异性引物扩增HLA-DQB1位点第2和第3外显子，进而应用共同的测序引物进行双向测序分析，精确地确定HLA-DQB1的等位基因型。利用这些组特异性引物可以对样本的单体型进行有效分离，在新等位基因的鉴定方面有重要作用。此外，本专利技术可有效判定等位基因型的漏检情况，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种HLA‑DQB1基因分型的组特异性引物PCR‑SBT试剂，其特征在于：所述试剂由用于扩增HLA‑DQB1不同等位基因的6对组特异性引物和用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物组成；所述用于扩增的6对组特异性引物为：(1) 扩增HLA‑DQB1*02 组的特异性引物DQB1*02F：5'‑CTCGTCATTCCCTTGAACTG‑3'DQB1*02R：5'‑AACCACCGGACTTTGATCTG‑3'，(2) 扩增HLA‑DQB1*03:01组的特异性引物DQB1*0301F：5'‑TCAAAAGCTTGTGCTCTTTCAG‑3'DQB1*0301R：5'‑CAGTCCCTCCGAGCTATCAG‑3'，(3) 扩增HLA‑DQB1*03组（除DQB1*03:01外）和DQB1*04组的特异性引物DQB1*04F：5'‑GATGAGGTGAGCACAGTCGG‑3'DQB1*04R：5'‑CTCCGAGCTATCAGGACTGG‑3'，(4) 扩增HLA‑DQB1*05 组的特异性引物DQB1*05F：5'‑ACAGCAGGATTTGTCATTTCA‑3'DQB1*05R：5'‑GTCCTGTCTCCTCGCACTTC‑3'，(5)扩增HLA‑DQB1*06:01 组的特异性引物DQB1*0601F：5'‑GGAAATACAAGGCAGCAATGA‑3'DQB1*0601R：5'‑CCTGCTGAGGAGCTGAAGTC‑3'，(6) 扩增HLA‑DQB1*06组(除DQB1*06:01外)的特异性引物DQB1*0602F：5'‑CAAGACTGCCTGGACTTAGG‑3'DQB1*0602R：5'‑AGGACTGGGATTCAGAGCAA‑3'；所述4条寡核苷酸测序引物序列如下： DQB1‑2F：5'‑GGCCSGTGATTCCYCGCAG‑3'， DQB1‑2R：5'‑GGKCRACSMCGCTCACCTC‑3'， DQB1‑3F：5'‑CTTTYCCTGTCTGTTACTGC‑3'，DQB1‑3R：5'‑GGCCCAYARTAACAGAAACTC‑3'。...
【技术特征摘要】
1.一种HLA-DQB1基因分型的组特异性引物PCR-SBT试剂，其特征在于：所述试剂由用于扩增HLA-DQB1不同等位基因的6对组特异性引物和用于测序分析的4条寡核苷酸测序引物组成；
所述用于扩增的6对组特异性引物为：
(1) 扩增HLA-DQB1*02 组的特异性引物
DQB1*02F：5'-CTCGTCATTCCCTTGAACTG-3'
DQB1*02R：5'-AACCACCGGACTTTGATCTG-3'，
(2) 扩增HLA-DQB1*03:01组的特异性引物
DQB1*0301F：5'-TCAAAAGCTTGTGCTCTTTCAG-3'
DQB1*0301R：5'-CAGTCCCTCCGAGCTATCAG-3'，
(3) 扩增HLA-DQB1*03组（除DQB1*03:01外）和DQB1*04组的特异性引物
DQB1*04F：5'-GATGAGGTGAGCACAGTCGG-3'
DQB1*04R：5'-CTCCGAGCTATCAGGACTGG-3'，
(4) 扩增HLA-DQB1*05 组的特异性引物
DQB1*05F：5'-ACAGCAGGATTTGTCATTTCA-3'
DQB1*05R：5'-GTCCTGTCTCCTCGCACTTC-3'，
(5)扩增HLA-DQB1*06:01 组的特异性引物
DQB1*0601F：5'-GGAAATACAAGGCAGCAATGA-3'
DQB1*0601R：5'-CCTGCTGAGGAGCTGAAGTC-3'，
(6) 扩增HLA-DQB1*06组(除DQB1*06:01外)的特异性引物
DQB1*0602F：5'-CAAGACTGCCTGGACTTAGG-3...
【专利技术属性】
技术研发人员：何吉，朱发明，和艳敏，章伟，吕杭军，
申请(专利权)人：浙江省血液中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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