HLA基因特异性PCR扩增引物及HLA分型的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种HLA基因特异性PCR扩增引物及HLA分型的方法和试剂盒，其中，PCR扩增引物的序列包括：SEQ?ID?NO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10所示的引物序列；HLA基因分型的方法包括：利用HLA基因特异性PCR扩增引物，对样本DNA进行PCR扩增，纯化，利用基因外显子测序引物，对HLA基因扩增产物进行测序PCR扩增，纯化，测序，并与标准序列对比，确定HLA基因的型别；HLA基因分型的试剂盒包括：PCR扩增引物和测序引物。本发明专利技术在检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃，且数据更加可靠、真实，能避免当某些等位基因的核苷酸位于扩增区域之外时无法分型的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因的扩增引物及利用该引物进行基因分型的方法和试剂盒，特别是涉及一种HLA(人类白细胞抗原)基因特异性PCR扩增引物及利用该引物进行HLA分型的方法和试剂盒。
技术介绍
人类白细胞抗原(HLA)基因位于人类第6号染色体短臂，是目前发现的人体多态性最高的基因。HLA基因分成三类I类、II类和III类基因。其中，I类包括HLA-A、HLA-B、HLA-C 基因；II 类包括HL·A-DRB1、HLA-DQAl、HLA-DQBU HLA-DPAl、HLA-DPBl 基因。HLA系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现(Jean Dausset)第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫遗传学、免疫生物学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。现在，已基本弄清其系统的组成、结构和功能，闸明了其理化性质和生物学作用。这些研究成果不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的生物医学价值。随着医学的发展，像白血病、地中海贫血等能用最新的基因技术进行分型检测，再寻找合适的供体进行移植治疗。目前通过HLA高分辨分型的外周血干细胞移植技术能大大提高配型效果，使患者的康复更快，更有保征。目前国际上对HLA基因分型的方法有PCR-SSP(序列特异引物聚合酶链式反应)，PCR-SSO (聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)以及PCR-SBT (聚合链式反应产物直接测序分型)。其中，SSP法需要设计出一整套基因特异性引物，通过PCR技术获得特异性产物，通过电泳分析决定HLA基因型别。其缺点不易、不能检测新的等位基因；试剂盒需不断升级；检测的信号也只说模拟的信号，不直观可靠。SSO法的原理设计HLA基因型别特异的寡核苷酸序列作为探针，对PCR产物进行标记，以PCR产物与探针进行杂交。通过检测信号判断HLA基因型别。但该方法的缺点是不能检测新的等位基因，分辨率不高，检测信号为模拟信号。SBT法是一种通过对扩增后的DNA进行核酸序列测序，从而判断HLA基因型别的方法。该方法是一种最直观、最准确的方法，可广泛用于HLA基因的高分辨分型检测，但是该方法对扩增过程的引物序列要求很高，引物序列直接关系到整个型别的确定，一对好的特异性引物是该方法成功的关键。因此，为改变目前落后的HLA基因分型方法，需研发一种更加有效，且在检测通量、数据质量、成本控制等方面，更有优势的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种HLA(人类白细胞抗原)基因特异性PCR扩增引物及利用该引物进行HLA分型的方法和试剂盒。通过本专利技术的HLA分型方法能大大提高配型效果，使患者的康复更快，更有保征。由于该方法应用测序技术，只需通过一次实验就能够确定HLA分型，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时，还可发现新的等位基因，在检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃。为解决上述技术问题，本专利技术的HLA基因特异性PCR扩增引物，其序列包括SEQIDN0. 1-2所示的引物序列，SEQ ID NO. 3_4所示的引物序列，SEQ ID NO. 5_6所示的引物序列，SEQ ID NO. 7-8所示的引物序列和SEQ ID NO. 9_10所示的引物序列。所述SEQ ID NO. 1_2所示的引物序列是用于扩增HLA-A基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。所述SEQ ID NO. 3-4所示的引物序列是用于扩增HLA-B基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。所述SEQ ID NO. 5-6所示的引物序列是用于扩增HLA-C基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。所述SEQ ID NO. 7-8所示的引物序列是用于扩增HLA-DRBl基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩 增所得到的产物的片段大小为270bp。所述SEQ ID NO. 9-10所示的引物序列是用于扩增HLA-DQBl基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3800bp。另外，本专利技术还提供一种基因外显子测序引物，该基因外显子测序引物是对于由上述HLA基因特异性PCR扩增引物扩增得到的HLA基因扩增产物的基因外显子测序引物，包括=HLA-A基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA-B基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA-C基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA-DRBl基因的2号外显子的测序引物和HLA-DQBl基因的2、3号外显子的测序引物；其中，HLA-A基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括SEQ ID NO. 11-15所不的测序引物序列；HLA-B基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括SEQ ID NO. 16-20所示的测序引物序列；HLA-C基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括SEQ ID NO. 21-25所示的测序引物序列；HLA-DRBl基因的2号外显子的测序引物，其序列包括SEQ ID NO. 26-27所示的测序引物序列；HLA-DQBl基因的2、3号外显子的测序引物，其序列包括SEQ ID NO. 28-30所示的测序引物序列。上述的HLA基因特异性PCR扩增引物和基因外显子测序引物的序列，可如表I所/Jn ο表IPCR扩增引物对及测序弓I物对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于：其序列包括：SEQ?ID?NO.1?2所示的引物序列，SEQ?ID?NO.3?4所示的引物序列，SEQ?ID?NO.5?6所示的引物序列，SEQ?IDNO.7?8所示的引物序列和SEQ?ID?NO.9?10所示的引物序列。

【技术特征摘要】
1.ー种HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于其序列包括SEQ ID NO.1-2所示的引物序列，SEQ ID NO. 3-4所示的引物序列，SEQ ID NO. 5_6所示的引物序列，SEQIDNO. 7-8所示的引物序列和SEQ ID NO. 9_10所示的引物序列。2.如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于所述SEQ IDNO.1-2所示的引物序列是用于扩增HLA-A基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。3.如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于所述SEQIDNO. 3-4所示的引物序列是用于扩增HLA-B基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。4.如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于所述SEQIDNO. 5-6所示的引物序列是用于扩增HLA-C基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。5.如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于所述SEQIDNO. 7-8所示的引物序列是用于扩增HLA-DRBl基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为270bp。6.如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于所述SEQIDNO. 9-10所示的引物序列是用于扩增HLA-DQBl基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3800bp。7.ー种基因外显子测序引物，其特征在于所述基因外显子测序引物是对于由如权利要求I所述的HLA基因特异性PCR扩增引物扩增得到的HLA基因扩增产物的基因外显子测序引物，包括HLA-A基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA-B基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA-C基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA-DRBl基因的2号外显子的测序引物和HLA-DQBl基因的2、3号外显子的测序引物； 其中，HLA-A基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括SEQ ID NO. 11-15所示的测序引物序列； HLA-B基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括SEQ ID NO. 16-20所示的测序引物序列； HLA-C基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仲征，黄锟，潘捷，邢宽，龙飞艳，卓孝福，王宁娟，
申请(专利权)人：上海荻硕贝肯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：