本发明专利技术涉及引物及该引物检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法，包括（1）提取RNA；（2）RNA反转录合成cDNA；（3）以cDNA为模板，分别以BCR(p210)-F和ABL(p210)-R为上下游引物，BCR(p190)-F和ABL(p190)-R为上下游引物进行第一轮PCR扩增，获得扩增产物；（4）以ABLKinase-F和ABL?Kinase-R为上下游引物进行第二轮PCR扩增；（5）扩增产物测序。本发明专利技术还公开了利用巢式PCR获得BCR/ABL融合基因中ABL激酶区片段，再利用特异性引物进行测序的方法，在一个反应体系中可以检测所有常见的BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变，降低了实验的成本，极大的提高了基因测序结果的准确性和灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，具体来说是引物及该引物检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法。
技术介绍
慢性髓细胞性白血病(chronicmyeloid leukemia, CML)细胞有 t (9 ；22) (q34 ；qll)易位形成的费城染色体(Ph chromosome)和BCR/ABL融合基因，它们在血液病研究中占有重要地位。在发现Ph染色体后的30多年里，临床广泛用细胞遗传学方法检测Ph染色体做CML的诊断和疗效监测。尤其近十余年，分子生物学方法检测BCR/ABL融合基因的应用逐渐普及。甲磺酸伊马替尼(别名格列卫，imatinib)是针对BCR/ABL融合蛋白设计的十分有效的药物，近几年在CML和Ph+急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocyticleukemia, ALL)治疗中应用越来越多，但是部分患者最终出现耐药，耐药相关的BCR/ABL融合基因ABL激酶区突变检测备受重视。BCR/ABL融合基因见于95%以上CML患者，也见于20% 25%成人ALL和2% 4%儿童ALL患者,约6%成人急性髓细胞性白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)、1%儿童AML和10%急性混合细胞型白血病(acute mixed lineage leukemia, AMLL)患者中也可检测到Ph染色体和BCR/ABL融合基因。不同的BCR/ABL融合基因类型与疾病表型相关。BCR/ABL融合基因中，主要由ABL段携带细胞恶变的主要信息，而BCR段的断裂位点主要影响疾病表型。ABL基因断裂位点通常位于内含子1，包括了全部外显子2及以后的ABL基因序列。BCR基因常见的断裂点有三个:⑴M-BCR区，位于外显子bl b5之间5. 8kb的区域，转录成b2a2或b3a2型mRNA，编码210kD的BCR/ABL融合 蛋白(p210)，见于90%以上的CML和33%的Ph +成人BALL患者。(2)m-BCR区，位于外显子e2,和e2之间的54. 4kb的区域，转录成ela2型mRNA，编码190kD的融合蛋白(pl90)，见于2/3的Ph +成人BALL、3%的非典型CML和慢性粒细胞单核细胞白血病(chronic myelo-monocytic leukemia, CMML)患者。(3) μ-BCR 区,位于外显子19下游，转录成el9a2型mRNA，编码p230kD的融合蛋白，主要见于Ph +的慢性中性粒细胞白血病(chromic neutrophilic leukemia, CNL)。格列卫的使用使有些造血干细胞移植适应证的CML患者放弃了移植，但格列卫并不能根治CML。因为它通过抑制BCR/ABL融合蛋白的激酶活性发挥作用，本身并不能抑制融合蛋白的形成，因此停药后易复发。格列卫临床应用不久就发现耐药现象，可分为原发性耐药和继发性耐药。耐药的发生机制包括(1)BCR/ABL融合蛋白的ABL激酶区发生突变，使格列卫结合位点酪氨酸激酶结构域的空间构象发生改变，导致格列卫不能竞争性结合融合蛋白；(2)BCR/ABL融合蛋白过度表达，超过了格列卫的竞争结合能力；(3)BCR/ABL融合基因基因组拷贝数的扩增，往往也会导致BCR/ABL融合蛋白的过度表达；(4) CML克隆的增生不完全依赖BCR/ABL，还存在其他基因异常，如多药耐药基因的异常等。可能上述一种或多种机制一起导致耐药，但约80%的耐药是由于BCR/ABL融合蛋白的ABL激酶区突变引起的，已报道的突变超过50种。约10%的耐药是由于BCR/ABL融合基因的过量表达导致的，可能是由于基因组中BCR/ABL融合基因的扩增或其他非典型Ph染色体的出现，这种情况下增加药物剂量通常能达到一定的效果。部分患者在使用格列卫治疗前就携带有突变的克隆，是原发性耐药的主要原因。突变克隆的扩增可能是一个渐进的过程，开始阶段突变克隆比例较低，但一旦出现会很快增高并导致疾病的进展。在病情稳定或BCR/ABL融合基因定量逐渐降低的情况下，很少能检测到突变的情况。在格列卫初治的患者和已获得完全细胞生物学缓解的患者中突变的情况也比较少见。耐药的突变往往出现于CML急变期前或伴随急变期出现，因此定期监测突变情况是必要的，可以及早发现突变并相应调整治疗方案。对于某些预后不良的突变来说，在低水平时就较早地检测出来是非常有意义的。目前发现的ABL激酶区突变主要集中于ATP结合区(P环，第244 255氨基酸)、T315及活化区(A环)，不同突变位点引起的耐药程度不同。部分突变患者可以对新型的激酶抑制剂达沙替尼(Dasatinib，BMS-354825)或尼罗替尼(Nilotinib，AMN 107)有治疗反应，可作为格列卫的替代用药。发生于P环的突变耐药性强，如G250E、Y253H及E255K等突变耐药程度都很高。目前报道的突变中，尤以T315I耐药程度最高，是惟一报道对所有激酶抑制剂都耐药的突变。这些高度耐药的突变预后差，需尽早改用其他治疗方案。而M351T、E355G、M244V等耐药程度不高，可以通过提高剂量来抵抗耐药。因此，在用格列卫治疗前对患者的BCR/ABL融合基因ABL激酶区进行测序，可以有效地为综合定量监测和格列卫耐药突变等情况做一个评估，根据每位患者的病情和疾病的发展，进行精确的个体化治疗。由于BCR/ABL融合基因跨越片段长，已报道ABL激酶区突变种类多达五十几种且还存在未知突变类型，目前对于检测BCR/ABL基因耐药突变，只有针对某一个或某几个已知突变位点用传统的RQ-PCR 方法进行检测，远远无法满足临床医生对患者的全面认识而做出正确的诊断并实施个体化的治疗方案。本检测采用巢式PCR和Sanger测序方法能够对ABL激酶区所有突变进行检测，并且具有高度的准确性和灵敏度
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够检测多种BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是引物，包括扩增引物和测序引物，所述扩增引物序列如下BCR_p2IO-F: 5，-TGACCAACTCGTGTGTGAAACTC-3，、ABL_p210-R :5’ -TCCACTTCGTCTGAGATACTGGATT-3’、BCR_p 190-F: 5，-ACCGCATGTTCCGGGACAAAAG-3，、ABL_pl90-R :5’ -ACAGCATTCCGCTGACCATCAATAAG-3’、所述测序引物序列如下ABL Kinase-F :5’ -TGGTTCATCATCATTCAACGGTGG-3’、ABL Kinase-R :5’ -AGACGTCGGACTTGATGGAGAACT-3’。进一步的所述的引物序列是向扩增引物或测序引物的5’端或/和3’端延长的序列。进一步的所述的引物序列是和扩增引物或测序引物同源性大于85%的序列。进一步的所述的引物序列是与扩增引物或测序引物碱基序列互补的序列。 进一步的所述的引物序列是由扩增弓I物或测序弓I物序列中的任意一种或一种以上的组合序列。一种利用上述引物检测BCR/ABL融合基因ABL激酶区耐药突变位点的方法，包括以下步骤(I)、提取 RNA;(2)、本文档来自技高网...
【技术保护点】
引物，包括扩增引物和测序引物，其特征在于：所述扩增引物序列如下：BCR_p210?F:5’?TGACCAACTCGTGTGTGAAACTC?3’、ABL_p210?R：5’?TCCACTTCGTCTGAGATACTGGATT?3’、BCR_p190?F:5’?ACCGCATGTTCCGGGACAAAAG?3’、ABL_p190?R：5’?ACAGCATTCCGCTGACCATCAATAAG?3’、所述测序引物序列如下：ABL?Kinase?F：5’?TGGTTCATCATCATTCAACGGTGG?3’、ABL?Kinase?R：5’?AGACGTCGGACTTGATGGAGAACT?3’。
【技术特征摘要】
1.引物，包括扩增引物和测序引物，其特征在于所述扩增引物序列如下BCR_p2IO-F:5， -TGACCAACTCGTGTGTGAAACTC-3，、ABL_p210-R :5’ -TCCACTTCGTCTGAGATACTGGATT-3’、BCR_pl90-F:5， -ACCGCATGTTCCGGGACAAAAG-3，、ABL_pl90-R :5’ -ACAGCATTCCGCTGACCATCAATAAG-3’、所述测序引物序列如下ABL Kinase-F :5’ -TGGTTCATCATCATTCAACGGTGG-3’、ABL Kinase-R :5’ -AGACGTCGGACTTGATGGAGAACT-3’。2.根据权利要求1所述引物，其特征在于所述的引物序列是向扩增引物或测序引物的5’端或/和3’端延长的序列。3.根据权利要求1所述引物，其特征在于所述的引物序列是和扩增引物或测序引物同源性大于85%的序列。4.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：李小青，孙黎，陈然，叶贵，李金欢，郝玮，梁超，韩韬，涂赞兵，方国伟，陈贵，黄士昂，
申请(专利权)人：武汉康圣达医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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