本发明专利技术属于分子生物学和医学领域，涉及一种检测生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法及其检测试剂盒。本发明专利技术提供了一种检测结核分枝杆菌基因片段的方法，它包括检测结核分枝杆菌RD2区的Rv1980c基因，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等污染。本发明专利技术还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增Rv1980c基因片段的引物。利用本发明专利技术检测生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为实验室生物安全控制及预防实验室获得性感染提供了一个简捷的新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和医学领域。涉及检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，具体涉及检测生物安全实验室与医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法；尤其涉及检测结核分枝杆菌RD2区，该区域Rv1980c基因相关的检测具有很高的灵敏性与特异性。本专利技术还涉及检测Rv1980c基因的方法和试剂盒。
技术介绍
据报道，从事传染性病原微生物诊断与研究的工作人员，在实验室内进行大量活细菌培养或接触感染动物的操作过程中，因实验操作不可避免形成感染性气溶胶而造成实验区台面、个人防护装备的表面等微环境的污染，从而形成工作人员职业暴露，容易造成实验室获得性感染（laboratory acquired infection）。 结核病是对人类公共卫生、人类健康及经济社会具有很大挑战的严重且古老的传染病， WHO统计报道全球结核病年发病数900万，其中传染性结核病人390万，每年约有220万死于结核病。我国结核病的年发病数占全球14.3%，位居第二位，2010年结核病流行病学抽样调查结果估算，全国活动性肺结核患病率为392/10万，其中传染性肺结核患病率为122/10万。控制结核病发展的有效方案是早期诊断和早期治疗，自患者痰标本分离培养M.tb是诊断结核病诊断的金标准之一，同时M.tb药敏试验的结果是指导临床用药的依据，因此实验室操作人员经常接触含有大量活的结核分枝杆菌的实验标本。 研究显示，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tb）是引起结核病的主要病原，其细胞壁含有大量的分枝菌酸，对干燥、理化等因素抵抗能力强，在环境中长时间保持活性与毒力，处于阴暗灰尘中可存活90~120天、痰中可存活6~8个月。少量M.tb的吸入（1-10个细菌）即可造成肺内感染。M.tb在卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》中（2006），属第二类高致病性病原微生物，其活菌培养及动物感染实验均需在BSL-3实验室中进行，临床样本的检测在医学检验实验室内开展。目前M.tb实验室获得性感染仍时有发生，提示在进行M.tb相关活动中实验室环境存在一定程度的污染尚未得到有效控制，为保障实验室生物安全，因此实验室环境存在的污染环节及感染概率尚待重视。 据调查，实验室M.tb相关的从业人员处于抗击结核病的第一线，实验室获得性结核感染（laboratory acquired M.tb infection）发生率高，主要感染方式大多是由于实验操作不当导致M.tb感染性气溶胶扩散于微环境表面从而造成操作人员的吸入。Tiantao Cheng等利用大量程的粒子计数器实时检测了进行M.tb感染动物的BSL-3实验室空气污染情况，结果显示：实验室核心区空气中未检测到感染性M.tb粒子。目前对M.tb实验室污染的关键部位，及操作中可能发生较为严重的污染环节尚未见明确报道，对于M.tb实验室微表面环境污染及操作中导致污染潜在可能性有待研究。 综上所述，为了控制结核分枝杆菌实验室获得性感染，本领域迫切需要寻求实验室微环境污染检测的技术，并开发检测微环境表面污染的检测的方法、试剂盒，以及相关的控制措施。 与本专利技术相关的现有技术:[1]. RILEY, R.L., et al., Air hygiene in tuberculosis: quantitative studies of infectivity and control in a pilot ward. Am Rev Tuberc, 1957. 75(3): p. 420-31.[2]. Singh, K., Laboratory-acquired infections. Clin Infect Dis, 2009. 49(1): p. 142-7.[3]. WHO, WHO Global Tuberculosis Control WHO Report 2010. 2010.[4]. 卫生部发布全国第五次结核病流行病学抽样调查结果, 2011.。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，具体涉及检测生物安全实验室与医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法；尤其涉及检测结核分枝杆菌RD2区，该区域Rv1980c基因相关的检测具有很高的灵敏性与特异性。本专利技术还涉及检测Rv1980c基因的方法和试剂盒。 本专利技术提供了一种生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，即检测结核分枝杆菌RD2区的Rv1980c基因，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等污染。 为了特异的检测实验室微环境表面M.tb的污染，需要选择M.tb基因组特异性的基因作为检测的靶基因。本专利技术根据在线数据库http://www.tbdb.org的全基因组比对软件Synteny MAP对M.tb、BCG、M.S全基因组序列进行比对，选择M.tb 基因组DNA差异区（Region of difference，RD）作为检测M.tb DNA的靶基因。 本专利技术中，所述的Rv1980c基因位于RD2区序列中，扩增的片段为结核分枝杆菌复合群所特有的区域，从而区别于BCG、耻垢分枝杆菌等非结核分枝杆菌的污染。本专利技术的检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，其包括：检测样本中RD2区域Rv1980c基因的相对量，以此判断所采样区域结核分枝感染污染的严重程度。 更具体的，本专利技术的检测方法，其特征在于，其包括步骤：（a） 抽提样品的基因组DNA，扩增获得Rv1980c基因序列中部分片段区域；（b）检测步骤（a）扩增片段的荧光值与标准品荧光值比较，从而判断生物实验室微环境表面结核分枝杆菌污染的严重程度。 本专利技术的检测方法尤其适用于检测生物安全实验室与医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染。 本专利技术中，所述的扩增Rv1980c基因片段引物序列如SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO 2所示。 上述方法中涉及的测序、扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操作方法。例如，所述的扩增可以采用实时定量PCR反应；其中，退火的温度是60摄氏度。循环数为30。 在本专利技术的一个实施例中，与特异性扩增RD2区Rv1980c片段引物的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。 本专利技术证实了RD2区Rv980c基因检测可用于生物安全实验室及医学检验实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的检测，并且具有高特异性与灵敏性。在此基础上完成了本专利技术。 本专利技术提供了一种检测样品是否存在结核分枝杆菌污染及污染严重程度的方法，包括步骤：(a) 用 Rv1980c基因序列特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和(b) 与提供的标准重组质粒标准品扩增产物荧光值对照从而检测样品中结核分枝杆菌的相对量。结核分枝杆菌RD2区域基因Rv1980c位点的详细序列可参见网址http://www.ncbi.nlm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，其特征在于，通过下述步骤，检测结核分枝杆菌Rv1980c基因： 步骤(a)抽提样品的基因组DNA，扩增获得Rv1980c基因序列中部分片段区域； 步骤(b)检测步骤(a)扩增片段的荧光值与标准品荧光值比较，从而判断实验室微环境表面结核分枝杆菌污染的严重程度。
【技术特征摘要】
1.一种检测实验室结核分枝杆菌微环境表面污染的方法，其特征在于，通过下述步骤，检测结核分枝杆菌Rv1980c基因：
步骤(a)抽提样品的基因组DNA，扩增获得Rv1980c基因序列中部分片段区域；
步骤(b)检测步骤(a)扩增片段的荧光值与标准品荧光值比较，从而判断实验室微环境表面结核分枝杆菌污染的严重程度。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的Rv1980c基因位于结核分枝杆菌RD2区。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增Rv1980c基因片段引物序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。
4.如权利要求1所述的检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩文东，瞿涤，孙志平，丁悦娜，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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