水稻细胞质雄性不育恢复基因RFFA及其应用制造技术

本申请提供了一个水稻细胞质雄性不育恢复基因RFFA的分离克隆、功能验证及其在改良水稻中的应用。本申请具体提供了基因RFFA的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列，包含基因RFFA的核苷酸序列的表达载体，利用基因RFFA创制水稻恢复系以及使水稻细胞质雄性不育系恢复育性的方法和相关用途。的方法和相关用途。

【技术实现步骤摘要】
水稻细胞质雄性不育恢复基因RFFA及其应用


[0001]本申请涉及植物基因工程
，具体涉及一个控制水稻细胞质雄性不育育性恢复基因RFFA的克隆、分离、功能验证及其在水稻改良中的应用。

技术介绍

[0002]植物在发育过程中，由于受环境条件影响或自身遗传突变导致雄性生殖系统退化不能产生花粉或者产生的花粉缺乏正常功能，而雌性生殖系统发育正常的一种生物学现象称为雄性不育。具有雄性不育遗传特征的作物品种或品系称为不育系。而有些作物品种(品系)与不育系杂交产生的杂交种能恢复正常的育性，这些作物品种(品系) 称为恢复系。不育系和恢复系在作物杂种优势利用和杂交育种上有重要的生产应用价值。
[0003]目前，雄性不育及其育性恢复的研究已经在多种农作物如小麦、玉米、油菜和水稻(Oryza sativa)中报道，在生产上已大规模用于杂交种生产。雄性不育包括由细胞核基因控制的核不育和由细胞质基因控制的细胞质雄性不育(cytoplasmic malesterility,简称CMS)。在水稻中细胞核雄性不育基因主要有pms3和tms5等，其育性受光照和温度的影响，在此基础上提出了水稻两系法育种途径。两系法育种灵活地利用了核不育系的育性转换特点,具有不育性遗传行为简单、恢复源广等诸多优势。但两系核不育系的育性容易受光温条件波动的影响,给不育系的繁殖和杂交种的制种造成了很多困难。三系法杂交育种的遗传基础是细胞质雄性不育系及其保持系和恢复系。其中不育系线粒体基因组中的特异基因编码的蛋白能导致雄性不育。保持系具有正常的细胞质，其核基因组与不育系基因组相同，其花粉正常可育，可自交结实。保持系与不育系杂交能产生不育系种子，使不育系能繁殖下去。恢复系的核基因组中携带有恢复功能的基因，其花粉正常可育，可自交结实。恢复系与不育系杂交产生杂种 F1种子，其育性正常可育。三系杂交育种是充分利用杂种优势，保证粮食生产安全的重要体现与保证。
[0004]水稻的细胞质雄性不育主要有“野败”、“包台”、“红莲”等类型，我国杂交水稻主要是利用“野败”型不育。野败型不育系(CMS
‑
WA)为籼型细胞质雄性不育系，是中国三系杂交稻中应用最早的类型，配制的杂交组合也最多，是目前中国生产上应用的最主要的水稻不育系类型。近年来所培育的组合和推广面积呈上升趋势的印水型、冈型、D型和矮败型等胞质不育类型，也与野败型不育系具有相似的恢保关系。野败型不育系为孢子体不育，研究认为，野败型细胞质雄性不育性和恢复性受两对主效基因作用的同时，还可能受微效基因的修饰作用。多数研究报道认为野败型雄性不育恢复基因的遗传受2对基因控制，这2对基因间独立遗传，并存在一定的互作效应。Yao (1997)等利用野败型珍汕97A和明恢63进行育性恢复的遗传研究，结果认为野败型恢复系明恢63具有2对显性恢复基因。随后分别用IR24和明恢63构建的遗传群体定位并克隆了Rf4同时，通过序列分析发现它编码一种PPR(pentatricopeptide repeatproteins)结构的蛋白(Tang et al.2014；Kazama et al.2014)。
[0005]水稻红莲型雄性不育胞质(CMS
‑
HL)来源于红芒野生稻，为籼型细胞质雄性不育系
类型。但红莲型和野败型在恢保关系、遗传特点、花粉败育的细胞学特征上明显不同，红莲型属于典型的配子体不育类型。对于红莲型恢复基因的定位，黄青阳等 (1999)通过SSR标记，将红莲型雄性不育的恢复基因Rf
‑
5定位在第10染色体上，与 RM258的遗传距离为7.8cM。Huang等(2012)通过粤泰A和9311构建了F2和BC1F1群体把红莲型细胞质雄性不育的两个恢复基因Rf5和Rf6分别定位于水稻第10染色体上标记RM6469和RM25661之间以及水稻第8染色体上标记RM3710和RM22242之间；并通过研究发现在仅携带Rf5或Rf6一个恢复基因的F1植株中50％的花粉粒可育，而同时携带Rf5和Rf6的杂种中75％花粉育性正常。携带两个非等位恢复基因的F1植株在逆境条件下，其结实率高于只携带一个恢复基因的F1植株(Huang et al.,2012)。Hu等在2012 年克隆了红莲型细胞质雄性不育恢复基因Rf5(Hu et al.,2012)，Huang等则在2015年克隆了红莲型细胞质雄性不育另一个恢复基因Rf6(Huang et al.,2015)，并对他们的调控机理进行研究。
[0006]目前生产上广泛应用的粳稻不育系主要为包台型细胞质雄性不育(CMS
‑
BT)，属配子体不育类型。日本学者Shinjyo(1975)对包台型三系的选育及遗传作过比较详细的研究，认为包台型雄性不育系的恢复性受1对显性基因控制。1996年，Akagi等以 2个近等基因系为材料，通过ISSR分子标记检测到共显性标记OSRRf与恢复基因Rf
‑
1 连锁，该标记位于第10染色体上，与Rf
‑
1的遗传距离为3.7
±
1.1cM。Komori等(2003) 选取第10染色体已知的9个与Rf
‑
1连锁的RFLP标记，用含有1024个个体的分离群体，对包台型恢复基因进行了精细定位，结果将Rf
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1精细定位于S12564Tsp509I和 C1361MwoI区间内，随后Komori等通过图位克隆的方法克隆了包台型细胞质雄性不育回复基因Rf
‑
1(Komori et al.,2004)。华南农大刘耀光课题组在2006年发现包台型细胞质雄性不育恢复基因Rf
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1位点包含两个恢复基因Rfla和Rflb，并对水稻CMS
‑
BT细胞质雄性不育机理和育性恢复功能进行了研究(Wang et al.,2006)。
[0007]我国杂交稻育种虽然取得了巨大的进步，但也长期存在一些需要解决的问题，主要原因之一就是目前生产上所用的不育细胞质主要为野败型细胞质，而其育性的恢复需要Rf3和Rf4基因同时存在时才能达到生产上的要求，这就导致新的恢复系选育难道较大。另一方面，野败型细胞质雄性不育系的育性不够稳定，在高温天气时会出现自交结实，制种时出现假杂种，导致种子纯度不过关(席建民等，2011；葛小平等，2012)。许多优良的稻种资源无法作为野败型保持系亲本利用，造成亲本间遗传基础狭窄，大大限制了产量提高的潜力。王乃元等在研究水稻雄性不育性在异源胞质背景的遗传表达过程中，从普通野生稻中发现一种新型的雄性不育细胞质，命名为CMS
‑
FA型细胞质，育成了系列新质源不育系，拓宽了优质米杂交稻的育种途径(王乃元，2006a)。在此研究基础上育成了新质源雄性不育恢复系，实现了新质源三系配套和利用(王乃元，2006b)。利用新型雄性不育细胞质源而培育的不育系具有广泛的保持系来源，不仅可以将保持系来源扩大到中稻、晚稻、优质稻等各个领域，而且打破了长江流域早籼稻系统的遗传局限，大大提高了不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻细胞质雄性不育恢复基因RFFA，其包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的细胞质雄性不育恢复基因RFFA，其由SEQ ID NO：1、2和3所示的核苷酸序列组成或者由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成。3.一种蛋白质，其由水稻细胞质雄性不育恢复基因RFFA编码，所述蛋白质包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或者由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成。4.一种核酸，其编码权利要求3所述的蛋白质。5.一种表达载体，其包含权利要求1或2所述的水稻细胞质雄性不育恢复基因RFFA或权利要求4所述的核酸。6.创制水稻恢复系的方法，其包括将权利要求1或2所述的水稻细胞质雄性不育恢复基因RFFA或权利要求4所述的核酸或权利要求5所述的表达载体引入水稻品种中。7.如权利要求6所述的方法，所述水稻品种选自水稻、旱稻、籼稻、粳稻、早稻、晚稻、粘稻、糯稻、稻叶有毛稻和稻叶无毛稻，任选地，所述引入通过基因编辑进行，任选地，所述基因编辑通过选自以下的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张启发，王乃元，周发松，蒋海潮，欧阳亦聃，陈美容，
申请(专利权)人：中国种子集团有限公司，
类型：发明
国别省市：