【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，具体地说，涉及一种利用单碱基基因编辑技术突变oswaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法。
技术介绍
1、随着人民群众生活水平的日益提高，对大米的消费逐渐转向优质化和专业化。目前，行业内公认的影响大米食味品质的最重要因素为直链淀粉含量，它与米饭质地的硬度、凝聚性和粘度等特性密切相关。在优质化方面，在ny/t593-2013食用稻品质定级指标中，籼稻和粳稻的一级米都要求直链淀粉含量在13％-18％之间，籼稻二级米要求在13％-20％，而三级米则在13％-22％之间。因此，直链淀粉含量是国家评价优质食用稻的重要关键性指标。与之对应的，保证直链淀粉的含量在13％-20％之间也是水稻优质化育种方向的重要目标。而随着大米消费专业化的发展，对大米直链淀粉含量的需求更加多样化，如专门用于做米粉的大米，或专门供糖尿病患者或高危人群食用的高抗性淀粉大米，甚至是南北方人民口感的差异，都要求在水稻育种中，能够快速精准调整直链淀粉含量，开发能够调整不同直链淀粉含量的生物技术。因此，开发精准调整直链淀粉含量的生物技术手段具有重要的商业价值。
2、oswaxy基因位于第6染色体的短臂，早在1990年就已被克隆，是决定直链淀粉合成的关键酶(wang et al.,1990)。过表达或降低oswaxy基因表达将导致贮藏器官中oswaxy基因酶活和直链淀粉含量明显上升或下降。通过突变体实验也发现，缺失oswaxy基因将获得直链淀粉缺失糯稻。oswaxy基因表达调控的机制目前还不完全清楚。除基因结构发生改变，影响其表达和蛋白功能外
3、基因编辑技术自诞生以来就成为生命科学领域的有力工具，最新一代的crispr/cas9由于其高效性和便捷性逐渐成为科研人员关注的焦点，在crispr/cas9系统中，向导rna(guide rna,grna)引导cas9蛋白在基因组的靶向位点进行精准切割造成dna双链断裂(double strand break,dsb)，宿主细胞利用自身的非同源末端连接(nonhomologous end-joining,nhej)或基于同源重组(homologous end recombination repair,hdr)进行修复。在研究基因功能时，通常会用到基因敲除(knock out)、敲入(knock in)、碱基置换(basesubstitution)等，在作物育种中，很多突变是单个核苷酸或者单个氨基酸突变造成的，因此相较于基因敲除和敲入，基于单碱基水平的精准修饰更具发展前景。2017年，david liu团队经过7轮的蛋白质分子进化与改造，突破性地开发出腺嘌呤碱基编辑器(adenine baseeditors，abes)。通过融合表达野生型以及突变型的腺苷脱氨酶tada和ncas9组成abe，abe通过sgrna的引导在靶向位置将腺嘌呤脱氨变成肌苷(inosine,i)，随后通过dna复制，dna聚合酶将i识别为g，从而实现非常高效的腺嘌呤到鸟嘌呤的转换(gaudelli et al.,2017)。在oswaxy基因功能研究过程中，除了模仿自然界中已知的变异外，利用单碱基基因编辑技术能够在基因编码区创制新的点突变，这些点突变位点大多数在自然界中不存在，因此，单碱基编辑技术能够创制大量的oswaxy基因的新等位基因，研究这些新等位基因的功能，不仅是解析稻米品质变异的重要途径，更是稻米品质改良的重要基础。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种利用单碱基基因编辑技术突变oswaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法。
2、为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种靶向oswaxy基因的单碱基基因编辑载体，所述载体包含腺嘌呤碱基编辑器和靶向oswaxy基因的特异性核酸酶。
3、本专利技术中，oswaxy基因编码的蛋白在ncbi上的参考序列编号为xp_015644490.1。
4、所述特异性核酸酶可选自crispr/cas9、crispr/cas12a、talen、meganuclease(归巢核酸内切酶)和zfn等中的任一种。
5、优选地，所述载体是基于crispr/cas9的腺嘌呤碱基编辑载体(abes)(图1)，所述载体至少包含第一表达盒和第二表达盒；
6、其中，abes载体的第一表达盒为ectada-ectada*7.10-ncas9表达盒；所述第一表达盒包含的核酸构建体ectada-ectada*7.10-ncas9的序列如seq id no:3所示。
7、第二表达盒为sgrna表达盒，且sgrna作用位点位于oswaxy基因的外显子上。
8、更优选地，sgrna作用位点的dna序列选自如下①～⑤中的任一个：
9、①5′-catcgaccatccgtcattcc-3′；
10、②5′-atccacaacatctcctacca-3′；
11、③5′-tcggcaggctggaggaacag-3′；
12、④5′-gacactggagttgattacaa-3′；
13、⑤5′-tcgtcaacggcatggacgtc-3′。
14、优选地，所述第一表达盒由甘蔗ubi4启动子驱动，所述第二表达盒由水稻u3启动子驱动。
15、第二方面，本专利技术提供所述靶向oswaxy基因的单碱基基因编辑载体在水稻育种和品种改良中的应用。
16、其中，育种目的为改良水稻直链淀粉含量。
17、第三方面，本专利技术提供利用单碱基基因编辑技术突变oswaxy基因改良水稻直链本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.靶向OsWaxy基因的单碱基基因编辑载体，其特征在于，所述载体包含腺嘌呤碱基编辑器和靶向OsWaxy基因的特异性核酸酶；
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第一表达盒由甘蔗Ubi4启动子驱动，所述第二表达盒由水稻U3启动子驱动。
3.权利要求1或2所述载体在水稻育种和品种改良中的应用，其中，育种目的为改良水稻直链淀粉含量。
4.利用单碱基基因编辑技术突变OsWaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1或2所述载体导入水稻中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述水稻为籼稻。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，突变OsWaxy基因编码的突变体包含OsWaxy蛋白第191位氨基酸由Y到H的突变。
7.改良水稻直链淀粉含量的方法，其特征在于，所述方法包括：利用基因工程手段，在水稻基因组中引入突变，使其编码的OsWaxy蛋白包含Y191H突变位点；
【技术特征摘要】
1.靶向oswaxy基因的单碱基基因编辑载体，其特征在于，所述载体包含腺嘌呤碱基编辑器和靶向oswaxy基因的特异性核酸酶；
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第一表达盒由甘蔗ubi4启动子驱动，所述第二表达盒由水稻u3启动子驱动。
3.权利要求1或2所述载体在水稻育种和品种改良中的应用，其中，育种目的为改良水稻直链淀粉含量。
4.利用单碱基基因编辑技术突变oswaxy基因改良水稻直链淀粉含量...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁琦，刘行丹，谭超，潘燕林，邱颖波，王文舒，陈雅，李弘婧，贾倩，刘建丰，马崇烈，
申请(专利权)人：中国种子集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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