本发明专利技术涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种使用杂交探针检测EGFR基因突变位点的试剂盒。本发明专利技术创造性的使用taqman探针、PNA探针与一种多重PCR方法结合来检测EGFR突变，所有的操作在一管内完成，操作简单，不需要开盖操作，避免了污染的发生。使用TM值来判断是否发生突变。并且提供了特殊的固体形式储存方式，大大方便了运输和储存。此试剂盒主要用于诊断非小细胞肺癌患者是否适宜用易瑞沙/特罗凯等分子靶向药物。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种使用杂交探针检测EGFR基因突变位点的试剂盒。本专利技术创造性的使用taqman探针、PNA探针与一种多重PCR方法结合来检测EGFR突变，所有的操作在一管内完成，操作简单，不需要开盖操作，避免了污染的发生。使用TM值来判断是否发生突变。并且提供了特殊的固体形式储存方式，大大方便了运输和储存。此试剂盒主要用于诊断非小细胞肺癌患者是否适宜用易瑞沙/特罗凯等分子靶向药物。【专利说明】荧光探针杂交法检测人EGFR基因突变试剂盒
本专利技术涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种使用杂交探针检测EGFR基因突 变位点的试剂盒。
技术介绍
非小细胞肺癌（NSCLC)在世界范围内相当普遍，是造成男女个体因癌症死亡的最 重要的原因，化学疗法对于治疗NSCLC显得无能为力，大约有85%的病人疗效不显著，在此 情况下，分子靶向药物作为新的疗法受到关注。表皮生长因子受体（EGFR)是一种酪氨酸蛋 白激酶，在许多肿瘤中过表达和（或）发生突变，通过信号转导控制肿瘤生长，并与新生血 管生成、肿瘤的侵袭和转移等有密切的关系。在非小细胞肺癌中，EGFR往往过量表达，然而， EGFR的表达多少并不能成为预测药物反应的一个有效指标，研究证实EGFR的突变对于药 物反应十分重要，不同外显子的突变将导致构象变化，改变和增强蛋白的活性，同样增强对 TKI的敏感性，易瑞沙和特罗凯作为分子靶向治疗药物被美国FDA批准使用，对109T15%的 病人有显著疗效。KI通过与ATP竞争结合EGFR胞内酪氨酸激酶区，阻止酪氨酸残基磷酸 化，从而阻止EGFR信号通路的传导，最终达到抑制肿瘤增殖、转移、血管生成等一系列肿瘤 细胞生物活动。通过检测肺腺癌患者EGFR的突变情况，以及与临床特征之间的关系，可以 筛选最合适的病人进行有针对性的靶向治疗提供依据，以避免不合理用药。 目前普遍应用的EGFR基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法（RFLP 法）和DNA直接测序，Taqman水解探针检测等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的 方法。但是该方法存在以下缺点：RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮 酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序 的原理是：该方法存在以下缺点检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染， 通量不高。DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、GC富集区的存在等问题使得很难通过 一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难 适用于临床检测。 Taqman水解探针法使用扩增阻滞突变系统（amplificationrefractory mutationsystem,ARMS)与突光探针结合来检测突变，理论上根据PCR扩增时使用的Taq DNA不能修正引物3'端碱基错配，只要引物3'端与模板1个碱基不配对，便无法扩增出特 异性产物。针对这种特性设计引物，使得突变型得到扩增，野生型无法扩增，从而放大了突 变型信号，便于检测。利用ARMS引物对突变靶序列进行PCR扩增，Taqman探针对扩增产 物进行特异性位点检测，在Real-timePCR基础上鉴定特定突变。该方法存在缺陷：ARMS 技术引物最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，所以这种方法存在假阳 性的风险，而且taqman结合arms检测EGFR需要分管操作，这样待测dna需要达到一定的 量，而且操作麻烦。 Taqman探针一般作为水解探针使用，这样在单个突变位点检测中使用较为广发， 但是涉及到多重突变检测，则检测位点个数受到通道限制。Taqmen探针作为杂交探针鲜见 有人提起，一般认为Taqman探针在自由状态及结合到模板时不发光，仅在核酸酶水解探针 时才发光。而经过我们研究证实，taqman探针在自由状态荧光值很低，而在结合到模板时， 由于双链的螺旋结构而处于直线状态，这样激发基团和淬灭基团由于相距一定的距离，而 使激发基团发出的光不被完全淬灭，而这种特性使taqman探针可以作为杂交探针使用。 多重不对称PCR(multiplex asymmetric per, MAP)对多个祀点进行不对称扩增， 扩增产物可以直接用于杂交而不需要经过单链分离过程，MAP包括特殊的引物设计方法，这 种引物设计使不同的引物具有较宽泛的退火温度，这样是多引物扩增时退火温度归一化， 极大的增加了多位点同时扩增的成功率。目前多重不对称PCR用于荧光平台未见专利报 道。 肽核酸（P印tideNucleicAcid，PNA)是近十几年发展起来的以中性酰胺键为骨 架的脱氧核糖核酸（^DeoxyribonucleicAcid，DNA)类似物，其结构介于多肽和DNA之间。 PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。PNA由于其自身的特点可以对 DNA复制、基因转录、翻译等进行有针对的调控，同时作为杂交探针大大提高了遗传学检测 和医疗诊断的效率和灵敏度。由于PNA能够与DNA和RNA特异性地结合，可以制备PNA探 针.与DNA探针相比，其杂交的稳定性和特异性大大增加。
技术实现思路
本专利技术创造性的使用taqman探针、PNA探针与一种多重PCR方法结合来检测EGFR 突变，所有的检测过程不需要开盖操作，避免了污染的发生。使用TM值来判断突变，而且所 有的检测在一管内完成，操作简单。提供了特殊的固体形式储存方式，大大方便了运输和储 存。 具体为： 1.优化了多重不对称PCR(MAP)在荧光平台的使用策略，MAP参见我们的申请专利 (201110448444. 8)，针对荧光平台，我们对整个体系以下优化。增加了镁离子浓度到6mM， 增加了焦磷酸酶来抑制PCR过程中产生的焦磷酸，增加了扩增策略来增强整个体系的扩增 能力。 2.针对18号和21号外显子突变序列设计Taqman探针，针对保守序列设计特殊 的MAP引物。对于18号外显子，本试剂盒可以检测G719S/A/C突变，所用通道设定为FAM 通道。对于21号外显子，本试剂盒可以检测L858R和L861Q的突变，所用通道为RED610通 道。对于这些点突变我们设定了Tm值的参考范围。 3.针对19号外显子突变热点多而且集中的特点，我们设计了特殊的PNA探针来 作为阻滞探针使用，在上游保守区域设计正向引物，在下游保守区域设计taqman探针和负 向引物，当模板为野生型时，其碱基完全匹配PNA探针，由于PNA不会被核酸外切酶水解， PNA探针阻滞PCR反应的进行，此时将不会有扩增产物，检测不到信号；而发生突变时，探针 Tm值大大降低，PNA探针从模板链上解离，per反应正常进行，这样，扩增出来的单链可以 使用Taqman杂交探针进行检测，所用通道为FAM通道。本试剂盒可以检测19号外显子上 E746-I751上的任何缺失突变，根据有无溶解曲线来判断是否发生了突变，但是不能区分具 体突变。 4.针对20号外显子，我们设计了保守的引物对和两个探针来检测突变位点，可以 检测S768I和I790M突变，以及20号外显子的插入突变，所用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人类EGFR基因突变的检测方法和试剂盒，其特征在于多重不对称PCR扩增，PNA/LNA探针作为阻滞探针，荧光杂交探针溶解曲线判断结果、以及包括固体形式存在的1xPCR反应物（由引物混合物、tris‑cl、Kcl、MgCl2 、热启动聚合酶、UNG酶和冻干保护剂组成）、其特殊之处在于：a：特殊的三段式引物，其三段式引物设计及后继的扩增为独创的MAP（多重单链PCR扩增）技术，其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4 、SEQ ID NO.5 、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7 、SEQ ID NO.8 ；b：特殊的探针，所选取的4个探针具有良好的特异性和保守性，可以根据Tm值的变化来判断突变，分别为SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO. 20；c：特殊的存储条件:本试剂盒为PCR反应物提供了固体形式的存储方式；d：反应条件通过优化，大致分为两个阶段，其中第一阶段为富集阶段，本阶段使用浓度极低的3个引物和一个过量的正向引物，反应温度一般为50℃左右，扩增阶段低浓度引物将被消耗完，随后第二阶段仅有负向引物工作，随着扩增的进行，将产生大量的单链目的核苷酸序列；e：特殊的阻滞探针，本试剂盒使用了特殊的PNA阻滞探针来屏蔽19号外显子野生型基因的表达，大大提高了诊断的准确性。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司，上海复星医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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