本发明专利技术公开了一种新的的酵母双杂交方法，该方法通过降低低丰度基因丢失率的文库扩增、酵母菌快速转化质粒、逐渐提高选择压筛选蛋白质互作并判断相互作用的强弱程度和富集表达β-半乳糖苷酶而发现弱互作的蛋白质。本方法操作简单，假阳性和假阴性少，采用本系统的酵母双杂交方法，不仅能够发现新的相互作用蛋白质，而且能够筛选到已知的阳性克隆。本发明专利技术公开的酵母双杂交方法可用于基因的新功能分析和相互作用网络图谱的绘制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的酵母双杂交方法，具体地说，本专利技术涉及一种新的系统筛选蛋白质相互作用的酵母双杂交方法，及该方法在信号转导、基因工程和蛋白质组学领域中有应用。
技术介绍
酵母双杂交系统是1989年由Fields和Song提出的(Fields S, et al. Nature, 1989，340:245 - 246 ；Fields S, et al. Trends Genet, 1994，10 (8) 286-92)，其作用原理基于真核细胞转录因子(如GAL4和GCN4蛋白质)的结构特性。转录因子通常含有两个独立的结构域DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)，只有当这两种结构域共同作用时才能使转录正常进行。利用此特性，可以分别使BD与AD同“诱饵”蛋白⑴和“猎物”蛋白 (Y)形成融合蛋白，一般把用来进行筛选的目的蛋白称为“诱饵”蛋白，而筛到的阳性克隆称为“猎物”蛋白。如果两种蛋白X和Y可以发生相互作用，就能使BD与AD在空间上充分接近，从而激活报告基因的转录；而单独的BD与AD蛋白质游离于细胞中不同的位置而分开， 不能激活报告基因的转录。目前公司开发出来的酵母双杂交系统有很多种，比如Clontech公司的 Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 系列、Invitrogen 公司的 ProQuest Two-Hybrid System等。系统中对应的酵母表达载体含有高拷贝的2u复制子(Clontech)，或者是低拷贝的ARS/CEN6复制子(Invitrogen)。其中的酵母菌种经过了基因改造后既不能产生GAL4， 又不能合成亮氨酸(LEU)、色氨酸(TRP)、组氨酸(HIS)、腺嘌呤(ADE)，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基(SD-LEU-TRP-HIS-ADE)上无法正常生长。当所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的这些报告基因从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。酵母双杂交的文库转化方法有两种，一种是直接将cDNA文库以质粒的形式转化到含有“诱饵”质粒的酵母感受态细胞中；另外一种是根据酵母有性生殖的特点，事先将cDNA文库质粒转化α接合型酵母细胞，将“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。α接合型和a接合型两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体(Bendixen C, et al. Nucleic Acids Res, 1994，22(9)1778—9)。酵母双杂交系统主要应用于快速验证已知蛋白之间的相互作用及寻找新的相互作用蛋白质，尤其在寻找蛋白质互作区域时相当有优势。其优点有1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使目的蛋白过量表达，方便复合物的形成。2、筛选过程在真核酵母活细胞内进行，一定程度上反映了体内的真实情况。3、检测的结果是基因表达产物的级联效应，通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用，而细胞内的免疫共沉淀依赖于两个互作蛋白质的解离程度，因为在免疫沉淀的过程中通过洗涤的过程降低了互作信号。4、通过激活区域与转录起始复合物蛋白的互作增强了杂交蛋白质的稳定性，提高了检测灵敏度。4、文库来源广泛，可采用不同组织、器官、细胞类型和特殊分化时期材料构建成cDNA文库(Luban J, et al. Curr OpinBiotechnol, 1995,6(1) :59_64)。根据不同的基因和蛋白质的特点，还可构建很多适用于筛选某个特定蛋白质的相互作用的酵母双杂交载体和系统，如有筛选激酶底物的酵母双杂交系统(Yang X，et al. Science，1992，257 (5070) 680-2)，有筛选药物配体的酵母双杂交系统(Yang Μ, et al. Nucleic Acids Res, 1995，23 (7) 1152-6)，有筛选核糖体 RNA合成酶相互作用蛋白质的酵母双杂交系统等(Nogi Y, et al. Proc Natl Acad Sci, 88(16)7026-38)。 虽然酵母双杂交技术得到了广泛的应用，但是系统本身也存在一些问题。首先， “诱饵”不能包含所有类型的蛋白质，如胞外蛋白、膜蛋白受体、和某些转录因子，这是由于酵母双杂交的原理决定的，重构的转录因子GAL4激活报告基因转录是在细胞核内发挥作用，所以“诱饵”蛋白质能否和在真核细胞中一样发生修饰和正确折叠(如糖基化和二硫键的形成)并转运至核内是进行筛选的前提条件。虽然现在开发出来的“诱饵”表达质粒插入了核定位序列，但不能排除某些必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质不能进入核内，或者因为加入了额外的融合蛋白质产生错误的构象而影响筛查结果(Allen JB, et al. Trends Biochem Sci, 1995，20 (12) 511-6)。其次，假阳性较多。即通过双杂交观察到的蛋白质间相互作用，在真实情况下不一定发生。其产生的原因可能是①由于有些蛋白质本身具有激活转录的功能，即使BD- X融合蛋白与AD-Y融合蛋白不特异结合，也能启动转录。有三种情况可以产生假阳性，即单独的AD-Y融合蛋白激活转录，AD-Y融合蛋白和空BD激活转录，AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白激活转录(Gietz RD, et al. Mol Cell Biochem, 1997，172(1-2) :67_79)。②在细胞的正常生命活动中靶蛋白和“诱饵”蛋白在时空上或者细胞类型以及组织中可能不在一起，而报告基因的表达是因为强行地将它们聚在了一起。如有些蛋白质的相互作用是在胞外因素刺激或者在特殊条件下才结合在一起，虽然酵母双杂交结果显示可以互作，但是后续的验证很难得到阳性结果而被认为是假阳性。③有些蛋白具有特殊的生物学功能和普遍的蛋白质相互作用，如一些蛋白水解酶和核糖体蛋白质。④一些实际上不发生相互作用的蛋白质由于有相同的模体可聚合在一起， 如含有大的疏水氨基酸残基的蛋白质能形成稳定复合物。最后，阴性干扰。即两个蛋白本应该发生相互作用，但报告基因不表达或表达量很低以至检测不出，原因主要有融合蛋白的表达对细胞有毒性(如细胞周期调控蛋白cyclin A和cyclin B)，有时为了抑制背景表达而在培养其中添加的3-AT (3-Amino-l, 2，4-triazole)也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相互作用可能会因此而被掩盖(James P, et al. Genetics, 1996，144(4) 1425-36)。目前的酵母双杂交方法存在操作复杂，难以寻找低丰度的基因所表达蛋白质的互作，假阳性和假阴性多的缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的酵母双杂交方法，本方法可增加低丰度基因数量提高筛选到阳性克隆的几率，操作简单，假阳性和假阴性少，通过酵母双杂交方法获得的结果可靠。本专利技术的另一个目的是提供新的酵母双杂交方法在筛选确认蛋白质新功能中的应用。本专利技术公开了一种新的酵母双杂交方法，该方法包括下列步骤1)文库扩增以大肠杆菌形式保存的组织或者细胞的CDNA文库，通过10倍梯度稀释测定文库的滴度，根据实际实验需要计算出扩增文库所需要的原始文库菌液的体积，实际扩增文库是在原始菌液所需本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种新的酵母双杂交方法，该方法包括下列步骤：１）文库扩增：以大肠杆菌形式保存的组织或者细胞的ｃＤＮＡ文库，通过１０倍梯度稀释测定文库的滴度，计算出扩增文库所需要的原始文库菌液的体积，实际扩增文库是在原始菌液所需体积的基础上增加１－３倍；２）诱饵质粒转化酵母细胞： 将用来筛选蛋白质相互作用的诱饵质粒与转化混合物一起直接加入酵母菌ＡＨ１０９中并进行热激转化以获得含有能表达诱饵蛋白的重组酵母菌；３）文库的转化和阳性克隆的筛选：将能表达诱饵蛋白的重组酵母菌通过选择培养基扩大培养后反应后的颜色变化肯定阳性克隆；５）测序分析后的共转化验证：测序并经过分析后的猎物质粒与诱饵质粒共转化到酵母菌ＡＨ１０９中以表达两个融合蛋白质，通过选择压筛选和β－半乳糖苷酶的活性测定进一步排除假阳性以肯定蛋白质相互作用的真实性。再转接到丰富培养基中培养并达到一定的浓度，然后将需要筛选的ｃＤＮＡ文库直接与转库混合物一起转化酵母菌，通过一系列的逐步增大的选择压筛选准阳性克隆；４）β－半乳糖苷酶的活性测定筛选阳性克隆：将准阳性克隆富集培养以高表达β－半乳糖苷酶，通过酶促
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周荣家，程汉华，陈述亮，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83
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