一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括：KRAS基因突变检测试剂、具核梭杆菌检测试剂、DNA亚硫酸盐转化试剂以及Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂；所述使用方法为采集粪便样本后使用试剂盒中试剂完成样本的DNA纯化、KRAS基因突变检测、具核梭杆菌丰度检测以及Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测，所得数据通过逻辑回归模型计算后进行结果评估及分析。本发明专利技术检测结直肠癌的灵敏度达到89％以上，特异性达到94％左右，能够实现结直肠癌高灵敏度和高特异性的检测，能够帮助医生指导病人后续治疗用药。

A diagnostic kit for colorectal cancer and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒及其使用方法。
技术介绍
结直肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，全球结直肠癌每年新发病例数约120万，年病死人数超过60万，发病率居第3位，病死率居第4位。近年来，结直肠癌的发病率呈明显上升趋势。据全国肿瘤登记中心发布的最新《中国肿瘤登记年报》，在全国范围内，结直肠癌等消化道癌症的发病和死亡人数逐年攀升，新发病人数约为40万人/年，死亡人数约为19.5万人/年。结直肠癌从最初的癌前发展至晚期有一个比较长的时间，但直到晚期才有明显症状显现(如腹痛，便血等)。由于大多数患者没有进行癌症早筛查的意识，发现症状后才到医院检查，至结直肠癌确诊时，癌细胞已经扩散，后期疗效不明显，致使中国近半数肠癌患者生存期不超过五年。结直肠癌早期治愈率高，通过手术可以很好地移除没有扩散的癌细胞，预后良好。因此，提高全民早期筛查意识以及提高早期肿瘤的筛查效率可以提高结直肠癌的整体生存率以及早期治愈率。目前临床上对于结直肠癌的早期诊断一般采用直肠指诊、X射线钡剂灌肠、乙状结肠镜或纤维结肠镜检查。目前结直肠癌相关的临床或实验室诊断方法有：1)粪便隐血检测(Fecaloccultbloodtest,FOBT)、粪便免疫化学测试(Fecalimmunochemicaltest,FIT)；FOBT是简单、方便、低成本的非侵入性结直肠癌筛查方法，但是存在特异性不高、试验种类(定性、定量)不统一等问题。2)内镜检查；结肠镜检查具有最高的灵敏度和特异性，是目前最普遍的筛查方法和金标准。然而，结肠镜检查是一种侵入性检查，具有穿孔、出血风险，且需要肠道准备，导致患者依从性差，不利于其推广。肠镜检查需要有丰富的临床经验，且不同的医生其判断标准有出入，误诊的情况并不少见。3)基因检测；2016年，美国食品药品监督管理局通过了EpiproColon的首个基于血液的结直肠癌筛选检测产品。该产品用于体外定性检测人外周血血浆中Septin9基因甲基化。目前，该产品已在美国、欧洲、中国以及其他地区上市。该产品在中国获得医疗器械注册证书之后，陆续有3款基于人外周血的Septin9基因甲基化检测产品上市。但是，公共甲基化检测数据库显示上皮来源的其他的良性病变以及其他组织来源的癌症都会释放Septin9基因片段到外周血，因此，导致该方法的特异性不高。4)粪便基因检测；2014年，美国食品药品监督管理局批准了首个非侵入性结直肠癌筛查试剂盒-Cologuard。该产品定性检测人类粪便样本中KRAS基因突变、BMP3基因与NDRG4基因甲基化以及血红蛋白水平。粪便基因检测相对于其他方法具有采样方便、最大程度降低病人不适等优点，但是，现有技术的检测试剂盒灵敏度和特异性都不高，在应用上具有一定的局限性。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒，能够解决现有技术在粪便基因检测结直肠癌病变方面灵敏度和特异性低等缺点。本专利技术还提出了上述试剂盒的使用方法。根据本专利技术的第一方面实施例的一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括：KRAS基因突变检测试剂、具核梭杆菌检测试剂、Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂。根据本专利技术实施例的结直肠癌辅助诊断试剂盒，至少具有如下有益效果：该结直肠癌辅助诊断试剂盒相对于现有技术，具有灵敏度和特异性更高、用药指导评价效果更好的效果。根据本专利技术的一些实施例，所述KRAS基因突变检测试剂中包含用于检测KRAS基因7种突变型的上下游引物和荧光探针；所述KRAS基因7种突变型为G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D的7种突变形式。作为优选的，检测KRAS基因7种突变型的上游引物包括核苷酸序列如SEQIDNo.1至SEQIDNo.7所示的7种引物，所述核苷酸序列如SEQIDNo.1至SEQIDNo.7所示的7种引物依次对应用于检测G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D的7种突变形式；所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。根据本专利技术的一些实施例，所述KRAS基因突变检测试剂中还包括用于KRAS基因突变检测的内参基因ACTB的上下游引物和荧光探针；所述内参基因ACTB的上下游引物包括核苷酸序列如SEQIDNo.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNo.11所示的下游引物；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。根据本专利技术的一些实施例，所述检测具核梭杆菌检测试剂包括检测具核梭杆菌丰度的上下游引物，所述检测具核梭杆菌丰度的上下游引物包括两个引物组。作为优选的，检测具核梭杆菌丰度的两个引物组包括核苷酸序列如SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示的引物组和核苷酸序列如SEQIDNo.15和SEQIDNo.16所示的引物组。根据本专利技术的一些实施例，所述具核梭杆菌检测试剂还包括PCR预混液和水；优选地，所述PCR预混液为HighRox。根据本专利技术的一些实施例，所述Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂中包括检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化水平的上下游引物和荧光探针。作为优选的，检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化水平的上下游引物和荧光探针分别为：检测Septin9基因甲基化水平的核苷酸序列如SEQIDNo.17和SEQIDNo.18所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQIDNo.19所示的荧光探针；检测SDC2基因甲基化水平的核苷酸序列如SEQIDNo.20和SEQIDNo.21所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQIDNo.22所示的荧光探针；检测HOXA11基因甲基化水平的核苷酸序列如SEQIDNo.23和SEQIDNo.24所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQIDNo.25所示的荧光探针；检测NDRG4基因甲基化水平的核苷酸序列如SEQIDNo.26和SEQIDNo.27所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQIDNo.28所示的荧光探针。根据本专利技术的一些实施例，所述Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂中还包括内参基因ACTB的上下游引物和荧光探针。作为优选的，所述内参基因ACTB的上下游引物和荧光探针包括核苷酸序列如SEQIDNo.29所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNo.30所示的下游引物；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.31所示。所述Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂中还包括DNA亚硫酸盐转化试剂。根据本专利技术的第二方面实施例的使用方法，包括以下步骤：...

【技术保护点】
1.一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：KRAS基因突变检测试剂、具核梭杆菌检测试剂、Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：KRAS基因突变检测试剂、具核梭杆菌检测试剂、Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述KRAS基因突变检测试剂中包含用于检测KRAS基因7种突变型的上下游引物和荧光探针；所述KRAS基因7种突变型为G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D的7种突变形式。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测KRAS基因7种突变型的上游引物包括核苷酸序列如SEQIDNo.1至SEQIDNo.7所示的7种引物，所述核苷酸序列如SEQIDNo.1至SEQIDNo.7所示的7种引物依次对应用于检测G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D的7种突变形式；所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。


4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述KRAS基因突变检测试剂中还包括用于KRAS基因突变检测的内参基因ACTB的上下游引物和荧光探针；所述内参基因ACTB的上下游引物包括核苷酸序列如SEQIDNo.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNo.11所示的下游引物；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述具核梭杆菌检测试剂包括检测具核梭杆菌丰度的上下游引物；所述检测具核梭杆菌丰度的上下游引物包括两个引物组，所述两个引物组包括核苷酸序列如SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示的引物组和核苷酸序列如SEQIDNo.15和SEQIDNo.16所示的引物组。


6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂中包括检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化水平的上下游引物和荧光探针。


7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测Septin9、SDC2、HOXA11和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王益民，周巧，高堂杰，戴应，何庆，杨婷，曹叶，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43