本发明专利技术公开了一种利用selex技术得到的能够高亲和力高特异性结合草甘膦的核酸适配体，该核酸适配体是一种单链DNA，由84个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其二级结构含有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-16.78；该核酸适配体通过酶联寡核苷酸吸附试验能特异性检测到草甘膦。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物医学技术领 域。
技术介绍
草甘膦属低毒除草剂，主要抑制植物体内的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，从而 抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质合成受到干扰，导致植物死亡。 而在果蔬、转基因大豆等制品中会有残留的草甘膦，人误食后15分钟内便产生呕吐及喉部 疼痛现象，接着还会产生腹痛及腹泻症状，另外，草甘膦还与先天性心脏病以及其他先天畸 形有关。因此，如何快速、准确、灵敏地检测出草甘膦防患于未然已成为亟待解决的问题。 核酸适配体是通过SELEX技术，从特定的寡核苷酸库中筛选得到的，能与靶分子 特异性、高亲和力地结合的一类寡核苷酸分子（DNA或RNA)。由于其具有靶分子范围广、分 子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点，核酸适配体在临床诊断鉴定和 疾病治疗领域中显示出了重要的应用价值。 专利技术人将本专利技术的草甘膦特异性核酸适配体的核苷酸序列和基因数据库进行了 比对搜索，未发现有任何相同序列信息。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与草甘膦特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序列如 SEQ ID N0 :1所示；该核酸适配体为单链DNA，由84个核苷酸组成，拓扑学结构为直链状； 预测的二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-16. 78。 本专利技术另一目的是将与草甘膦特异性结合的核酸适配体应用在识别草甘膦或在 制备检测草甘膦的试剂盒中。 本专利技术的技术方案如下： 1、 草甘膦特异性核酸适配体(A08)的筛选、克隆、分离和测序 采用SELEX技术筛选出能够与草甘膦特异性结合的核酸适配体群体，设计引物进 行PCR扩增、克隆、分离和测序。利用酶联寡核苷酸吸附试验（EL0NA)进行验证，得到 适配体A08,它能够高亲和力高特异性的结合草甘膦。配体接头引物序列为：Aptamer Fw: GACATAITCAGTCTGACAGC;反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC;Aptamer Rv: GCTAGACGATAITCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所获阳性单克隆进行 核苷酸序列测定，测序结果表明与草甘膦特异性结合的核酸适配体（A08)由84个核苷酸组 成，其序列（5'端至3'端）为： tgctagacga tattcgtcca tccgagcccg tggcgggctt taggactctg cgggcttcgc ggcgctgtca gactgaatat gtca ； 2、 核酸适配体（A08)单链DNA二级结构表征 使用 MF0LD 软件（http://mfold. rna. albany. edu/?q=mfold/DNA_Folding-Form)对与 草甘膦特异性结合的核酸适配体A08单链DNA分子进行二级结构预测，结果表明，其二级结 构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-16. 78,显示该结构具有较高 的稳定性；其二级结构如下：3、核酸适配体(A08)的特异性和对草甘膦的敏感性 根据核酸适配体A08的序列，用体外转录方法合成生物素标记的核酸适配体，建立了 一种新型的酶联寡核苷酸检测方法，通过此方法对A08的特异性和其对草甘膦的敏感性进 行检测；结果显示，A08具有很高的特异性，其能检测到草甘膦的最低浓度为4 ng/ y L。 本专利技术的意义在于： 利用SELEX技术筛选出的配体A08能够高亲和力高特异性的识别并结合草甘膦；核酸 适配体A08的鉴别对于食品中残留的草甘膦的检测，进而降低草甘膦对人体的侵害具有重 要意义。【附图说明】 图1为本专利技术中⑶圆二色谱法对K+浓度与核酸适配体A08的关系的分析； 图2为本专利技术中EL0NA法对核酸适配体A08的特异性分析，图中：空白对照1为草甘膦 +脱脂奶；空白对照2为草甘膦+不含配体的生物素；阴性对照1为苏丹红+标记有生物素 的配体A08 ;阴性对照2为三聚氰胺+标记有生物素的配体A08 ;阴性对照3为a -鹅膏毒 肽+标记有生物素的配体A08 ;阴性对照4为瘦肉精+标记有生物素的配体A08 ;阴性对照 5为乙型脑炎NS1蛋白+标记有生物素的配体A08 ;阴性对照6为乙型脑炎core蛋白+标 记有生物素的配体A08 ;草甘膦：草甘膦40 ng/iiL +标记有生物素的配体A08 ; 图3为本专利技术中Dot Blot法对核酸适配体A08的特异性分析，图中：1 :空白对照(草甘 膦+脱脂奶）；2 :空白对照(草甘膦+不含配体的生物素）;3 :阴性对照(苏丹红+标记有生 物素的配体A08) ;4 :阴性对照(三聚氰胺+标记有生物素的配体A08) ;5 :阴性对照（a -鹅 膏毒肽+标记有生物素的配体A08) ;6 :阴性对照（瘦肉精+标记有生物素的配体A08) ;7 : 阴性对照（乙型脑炎NS1蛋白+标记有生物素的配体A08) ;8 :阴性对照（乙型脑炎core蛋 白+标记有生物素的配体A08) ;9 :草甘膦40 ng/ y L +标记有生物素的配体A08 ; 图4为本专利技术中EL0NA法对核酸适配体A08的最佳浓度的分析，图中：空白对照1 :草 甘膦+脱脂奶；空白对照2 :草甘膦+不含配体的生物素；配体A08 :草甘膦+标记有生物素 的配体A08 ; 图5为本专利技术中EL0NA法对草甘膦灵敏度的分析，图中：空白对照：草甘膦+脱脂奶； 适配体A08 :草甘膦+标记有生物素的配体A08。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，实施例仅为了更好理 解本专利技术但不局限与本专利技术范围，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂 如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。 实施例1:草甘膦核酸适配体(A08)的筛选 一、配基(草甘膦）与基质(琼脂糖凝胶6B)的偶联 1、在3 mL蒸馏水中悬浮1 g的冻干粉末琼脂糖凝胶6B (1 g冻干的粉末能够产生出 大约3. 0 mL的最终的基质体积）； 2、立即在烧结玻璃滤器中（多空度G3)用大约每克粉末200 mL的蒸馏水冲洗1小时； 3、 用6 mL的偶联缓冲溶液（0. 05 M，pH 9. 6的碳酸盐缓冲液)溶解6 g的配基，使其最 终浓度为1 mg/mL，或者用脱盐柱将溶解的配基转移到偶联缓冲溶液中，调整水相的pH值； 4、 将基质与上述步骤3中的浓度为1 mg/mL溶解好配基的缓冲溶液的比例调整为体积 比1:2,在25°C到40°C的水浴条件下，混合16 h，并且37°C摇床过夜； 5、 在40°C到50°C的条件下，用1M的氨基乙醇封闭过剩的基团，至少4 h或者过夜； 6、 用偶联缓冲液洗过剩的配基，4000 rpm离心2 min，吸取上清；用超纯水(每次7-8 mL)清洗3次；紧接着用0. 1 M NaHC03,0. 5 M NaCl，pH 8. 0的溶液清洗3-4次；然后用0. 1 M NaCl，0. 1 M醋酸盐，pH 4. 0的溶液清洗3-4次；最后用质量百分比浓度为20%乙醇6 mL 保存，放置于4 °C冰箱，封口膜封口，竖直放置。 二、核酸适配体文库（ssDNA)的PCR 采用TaKaRa公司合成的ssDNA适配体文库本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与草甘膦特异性结合的核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩芹芹，乔璞，宋玉竹，张金阳，陈强，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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