一种核酸适配体的快速筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种核酸适配体的快速筛选方法。将待筛选的靶标分子固定在经过处理的微细管道内壁后，再将DNA或RNA的核酸文库分子流过管道与其内壁的靶标分子结合，然后用缓冲液冲洗掉与靶标分子未结合和结合弱的文库分子，得到与靶标结合的适配体分子。对此适配体分子进行扩增，获得富集后的子库。如果亲和力未达到预定要求，可以重复上述的过程若干次，直到达到要求的亲和力为止。利用本发明专利技术方法进行核酸适配体的筛选相对简单高效，成本低廉，容易实现，易于实现自动化。同时，还可以用于亲和力检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物
，特别是一种核酸适配体的筛选方法。
技术介绍
核酸适配体是由一段单链DNA或RNA组成的功能性的结构体，与抗体有着类似的 功能，能够与靶标分子特异性地高效结合，可应用于疾病诊断和治疗，食品检测与安全，环 境污染物检测等领域。由于适配体具有可人工快速合成，可体外扩增，在经历热变性后活性 不受影响等特性，克服了抗体生产周期长，稳定性差，储存条件要求高等缺陷，从而使其比 抗体具有更为广泛应用空间。体外获得适配体的技术最早于1990年由美国的三个实验室 独立建立，近年来适配体的应用文献快速增加。 尽管适配体的具有广泛应用的特性已经引起各国科学家的重视，但文献中报道的 高质量适配体数量非常有限，大量的文献研究仅基于少数几个适配体。如人凝血酶的适配 体自报道后，被700多篇文献引用并用于不同的应用场合。而通过筛选成功获得高质量适 配体的文献报道却非常少，高质量核酸适配体的筛选，已成为其广泛应用的瓶颈。因此，快 速获取高质量的适配体的筛选技术一直是国际上的研究热点。 已经报道的快速筛选方法主要有以下几类：一类是基于毛细管电泳的筛选方法， 这类方法筛选库容小，需要多次筛选，筛选周期长；另一类是磁珠的方法，相对是最成熟的 方法，但筛选效率低于毛细管电泳法。目前报道的自动化筛选方法也是基于磁珠法，这些自 动化筛选方法，仅仅是用机器代替手工，方法上并没有突破。还有一类方法是固相表面筛选 的方法。SPR-SELEX技术一是要求昂贵的仪器设备，所用的芯片价格昂贵，导致筛选成本较 高；其次，由于SPR-SELEX中用于筛选的芯片有效表面积很小，降低了文库分子与芯片表面 靶分子结合的概率，大量的文库分子没有机会与芯片表面的靶标分子结合就流走了，导致 筛选效率无法进一步提高；最后由于仪器中的管路系统易引入污染，导致筛选效率降低。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有核酸适配体筛选方法中多轮筛选周期长或需要贵 重仪器操作复杂的缺陷，而提出一种基于毛细管内壁偶联靶标分子的快速简便筛选方法。 本专利技术将毛细管内壁作为固相载体，克服了现有芯片筛选技术表面积不足，筛选效率低下 的缺点；相对于现有的磁珠筛选方法来说，本专利技术便于自动化，筛选效率更高。 为此本专利技术所采用的技术方案是： -种核酸适配体的快速筛选方法，包括以下步骤： ⑴对石英毛细管进行预处理，所述预处理是指将所述毛细管清洗干净后用 GTPS(3-(2, 3-环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷）（CAS :2530-83-8)(化学文摘社数据库： 2530-83-8)使所述毛细管内表面环氧基化，再用甘氨酸使所述毛细管内表面羧基化； ⑵用NHS/EDC (N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基）-碳化二亚 胺混合溶液）使所述毛细管内表面的羧基活化，再将靶标蛋白分子偶联在所述毛细管内表 面上； ⑶将文库分子溶液变性处理后压入所述毛细管内，使得文库分子中的目标核酸适 配体分子与所述靶标蛋白分子相结合；洗去未结合和弱结合的核酸适配体分子； ⑷对所述目标核酸适配体进行PCR扩增，再由所述扩增产物制备获得单链适配 体；并对获得的单链适配体进行SPR(表面等离子体共振）亲和力检测； (5)重复上述步骤⑶和⑷，筛选得到SPR亲和力高的单链适配体。 本专利技术的核酸适配体的快速筛选方法，其特征还在于：所述步骤⑴的环氧基化是 指将分析纯无水甲苯和GTPS按体积比4 :1混合后压入所述毛细管，两端封闭，于50°C~ 60°C反应12-16小时，吹出所述毛细管中的溶液，清洗，氮气吹干；所述羧基化包括将IOmg/ mL的甘氨酸溶液压入所述毛细管中34°C~40°C反应12 - 16小时后吹出所述毛细管中的 溶液，清洗，氮气吹干；所述甘氨酸溶液是由3M硫酸铵溶液配制，所述硫酸铵溶液是由0.1 M 磷酸盐缓冲液配制。 所述步骤⑵的偶联是指将用pH5. 0的IOmM NaAc缓冲液溶解的祀标蛋白压入所述 毛细管内，室温反应25~35分钟，再用50mM Tris-Cl缓冲液或者pH8. 5的IM乙醇胺封闭 后置4°C保存。 所述步骤⑶文库分子溶液是将Inmol文库分子溶解于100 μ L结合缓冲液中，所述 结合缓冲液为 ρΗ7· 4 的由 20mM HEPES、150mM NaCl、2mM KCl、2mM MgCl2 和 2mM CaCl2 组成 的溶液。 所述步骤⑵靶标蛋白分子选自HER2 (原癌基因人类表皮生长因子受体），PA(前白 蛋白）或SA(链霉未和素）。 所述步骤⑷制备单链适配体包括如下步骤：将所述PCR扩增产物用超滤管离心， 取离心管中的溶液加入到变性缓冲液中；变性后用冰水冷却，PAGE(聚丙烯酰胺凝胶） 电泳，分离切胶；沸水煮胶，取上清液超滤管离心，再纯化核酸；所述变性缓冲液为PH8. 0 的由 178mM Tris-HCl 、178mM Boric acid、4mM EDTA、7M Mrea、0. 6mM Ficoll、0. 3mM Bromophenol blue 和 0· 74mM Xylene Cyanole FF 组成的溶液。 所述SPR亲和力检测使用的芯片为CM5芯片或自制CM5芯片。所述自制芯片及其 制备方法详见"中国生物学杂志，2009, 29(1) :44 - 49" 本专利技术的技术方案具有以下有益效果： 1、利用本专利技术方法进行核酸适配体的筛选相对简单高效，成本低廉，容易实现，易 于实现自动化。本专利技术的筛选方法与常规的毛细管电泳筛选方法相比减少了筛选的重复次 数；与利用表面等离子共振仪的筛选方法相比，不需要昂贵的芯片耗材，减低了成本；与利 用复杂的微流控进行筛选的方法相比，操作简单，并且充分运用了毛细管电泳仪的自动进 样和清洗的功能，使得筛选易于实现自动化。 2、本方法中由于把分子偶联在管内壁上，与利用修饰磁珠进行的筛选方法相比， 不会因为磁珠操作困难，磁珠丢失而导致筛选失败，同时可以耐受高速冲洗，使得收集和清 洗过程简单。 3、本方法所用的管子内径和长度均可以控制，与利用表面等离子体共振仪的筛选 方法相比，提高了靶标分子与文库分子有效结合面积，充分提高了文库分子的结合几率；同 时由于结合和清洗无需额外配套的管路，极大地降低死体积，减少了引入额外的污染。 4、本方法中只要能将靶分子偶联到管子内壁即可，与常规的毛细管电泳筛选方法 相比，无需进行缓冲液的离子浓度及pH选择、电泳电压等分离条件的精细优化。【附图说明】 图1为本专利技术的筛选原理示意图。 图1中：管子：靶标分子： 核酸文库中不同形状的适配体分子 与靶标分子结合强的适配体分子 图2为本专利技术的HER2适配体亲和力检测结果。 图3为本专利技术的SA适配体亲和力检测结果。 图2和3中：横坐标为样品流过芯片表面的时间，纵坐标为结合值，结合值表不适 配体流过芯片表面时与芯片表面的靶标蛋白结合的强弱，结合值越高说明结合到芯片表面 的适配体越多。当适配体完全流过芯片后，通过结合值就可以观察到适配体从芯片表面与 靶标蛋白解离的曲线。解离曲线下降的程度也表明亲和力的强弱。下降得越快说明解离的 越多，表明亲和力越弱。【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明： 本专利技术的筛选原理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸适配体的快速筛选方法，包括以下步骤： ⑴对石英毛细管进行预处理,所述预处理是指将所述毛细管清洗干净后用GTPS使所述毛细管内表面环氧基化，再用甘氨酸使所述毛细管内表面羧基化； ⑵用NHS/EDC使所述毛细管内表面的羧基活化，再将靶标蛋白分子偶联在所述毛细管内表面上； ⑶将文库分子溶液变性处理后压入所述毛细管内，使得文库分子中的目标核酸适配体分子与所述靶标蛋白分子相结合；洗去未结合和弱结合的核酸适配体分子； ⑷对所述目标核酸适配体进行PCR扩增，再由所述扩增产物制备获得单链适配体；并对获得的单链适配体进行SPR亲和力检测； ⑸重复上述步骤⑶和⑷，筛选得到SPR亲和力高的单链适配体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周宏敏，左明艳，王延梅，罗昭锋，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34