【技术实现步骤摘要】
基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体
本专利技术涉及疾病检测
，具体为一种基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体。
技术介绍
目前常用于检测脑胶质瘤1p/19q染色体缺失的技术方法主要有：FISH技术、MPLA和微卫星分析。FISH技术即原位杂交技术，该技术的原理是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。该技术需要1p/19q探针，试验流程是：样本准备-脱蜡-预处理-消化-冲洗-杂交-洗涤-DAPI染色。值得一提的是，该技术是检测胶质瘤1p/19q缺失情况的金标准。MLPA技术即多重连接探针扩增技术，该技术的原理是探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会...
【技术保护点】
1.基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤（1）. 提取待检测样本的DNA，采用Qubit 3.0定量检测浓度，浓度合格作为高通量测序的模板；/n步骤（2）. 基因组 DNA 打断后进行末端修复；/n步骤（3）. 接头连接和接头连接产物纯化；/n步骤（4）. 预文库扩增后将扩增的预文库纯化；/n步骤（5）. 预文库杂交，用排枪 P10 加入转移 6.6μL B 组分至 48 孔板，P10吹打 10次混匀，短暂离心，盖上 8 连管盖，放入 S1000 PCR 仪； 95℃下 5 分钟,至第二步 65℃开始；将相应的 A 组分加到新的 8 连管里，每个样本 13μL, 盖上 8 连管盖，放入 PCR仪另一侧启动程序 65℃孵育 5 分钟；打开 A 组分管盖，将相应的 C 组分，每个样本 1.5μL；加到已含有 A 组分的孔里，吹打 5 次混匀，盖上管盖，65℃ 2 分钟；打开双侧 PCR 仪盖子及相应 8 连管盖，将 A+C 组分一共按每个样本 14μL的体积用 P20 排枪迅速转移到已含有 B 组分的杂交板孔，吹打 5 次混匀，每次取...
【技术特征摘要】
1.基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：包括以下步骤：
步骤（1）.提取待检测样本的DNA，采用Qubit3.0定量检测浓度，浓度合格作为高通量测序的模板；
步骤（2）.基因组DNA打断后进行末端修复；
步骤（3）.接头连接和接头连接产物纯化；
步骤（4）.预文库扩增后将扩增的预文库纯化；
步骤（5）.预文库杂交，用排枪P10加入转移6.6μLB组分至48孔板，P10吹打10次混匀，短暂离心，盖上8连管盖，放入S1000PCR仪；95℃下5分钟,至第二步65℃开始；将相应的A组分加到新的8连管里，每个样本13μL,盖上8连管盖，放入PCR仪另一侧启动程序65℃孵育5分钟；打开A组分管盖，将相应的C组分，每个样本1.5μL；加到已含有A组分的孔里，吹打5次混匀，盖上管盖，65℃2分钟；打开双侧PCR仪盖子及相应8连管盖，将A+C组分一共按每个样本14μL的体积用P20排枪迅速转移到已含有B组分的杂交板孔，吹打5次混匀，每次取样A+C需更换枪头；将八连管在板上盖紧，再贴上剪切成一半的microsealB贴膜以防止蒸干；热盖为105℃，65℃孵育16-24小时；
步骤（6）.捕获洗脱、终文库制备、终文库纯化。
2.根据权利要求1所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（2）中基因组DNA打断采用Covaris打断仪，检查Covaris水槽中注入新的去离子水的液面在12刻度水平，确保水面没过打断管玻璃部分；设置冷却温度在2℃~5℃，确保使用时温度显示水温在5℃；使用前最少30min打开控制面板上的排气按钮，参考Covaris仪器使用说明进行实验操作；在1.5ml的PCR管中将样品使用1XLowTEBuffer稀释为50μl/500ng将稀释好的样品小心的加入打断管中。
3.根据权利要求2所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（2）中末端修复方法为依据QubitdsDNAHS试剂盒标准流程，在1.5mLEppendorfLoBind管中准备30~80ngcfDNA或200ng白细胞打断样样本；在1.5mL管中加入ddH2O将样本稀释到50µL；涡旋振荡1.5mL管，台式微型离心机离心1-3秒；将1.5mL管中的50µL样本用单通道移液器P100转移到48孔板中，样本加至管底，做好记录标记样本顺序；在一个新的1.5mLEppendorfLoBind管中配制末端修复和加A反应体系混匀液；按1：1.1的比例配制混匀液，如24个样本建库，则配制27份混匀液；手指轻弹1.5mL管3-5次，上下颠倒混匀2-3次，台式微型离心机离心1-3秒；用单通道移液器P200取相应的混匀液均匀分到八连管管底，避免产生气泡；使用八通道移液器P20从八连管中吸取10µL混匀液至48孔板中，上下吹打10次，贴膜、刮板至紧密贴合；确保管内无气泡，使用甩板机瞬时离心至1000rpm保持3s；48孔板放入PCR仪Bio-RadT100或ABVeriti中，使用程序”ERA”，具体为85℃热盖，20℃下30分钟，65℃下30分钟，4℃Hold；2小时内进入下一步。
4.根据权利要求1所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（3）将完成反应程序”ERA“的48孔板从PCR仪取出，置于PCR管架上，甩板机离心至1000rpm保持3s，小心撕去封膜，冰上备用；冰上1.5mLEppendorfLoBind管中配制接头连接反应体系混匀液，按1：1.1的比例配制混匀液，如24个样本建库，则配制27份混匀液；手指轻弹1.5mL管3-5次，上下颠倒混匀2-3次，台式微型离心机离心1-3秒；用单通道移液器P200取相应的混匀液到八连管中；使用八通道移液器P200从八连管中吸取50µL混匀液至上述48孔板中，上下吹打10次，贴膜（microsealB）刮板至紧密贴合；管内无气泡，甩板机离心1000rpm3s；
将SPB磁珠上下颠倒2-3次，在VORTEX最大转速下混匀5-10s，使其均一化；在用单通道移液器P1000吸取相应的SPB磁珠到加样槽中，每个样本需要88µLSPB磁珠，如24个样本则在加样槽中加入2400µL磁珠；从PCR仪上取出48孔板，置与PCR管架上，1000rpm3s，小心撕去贴膜；用八通道移液器P200从加样槽中吸取88µLSPB磁珠加入到48孔板中；八通道移液器P200调至量程180µL，上下吹打10次；48孔板贴膜，瞬离1000rpm3s、置于室温10min；10min后，弃膜；48孔板置于96孔板磁力架上，待溶液澄清；弃膜，使用八通道移液器P200调至最大量程，弃上清，勿碰磁珠；48孔板仍置于磁力架上；采用移八通道移液器P200在样本孔中加入200µL新鲜配制的75%乙醇；在磁力架上来回水平移动48孔板使磁珠充分浸洗；待1min，弃乙醇；将48孔板静置在磁力架上1min，使用八通道移液器P20除净残留乙醇；将48孔板从磁力架上取下，置于PCR板架上室温2min，使磁珠干燥；以磁珠表面不反光，磁珠表面无裂痕为基准；在加样槽中加入适量的EB洗脱液；用八通道移液器P200在48孔板中加入28µLEB溶液，盖上八连管盖，vortex5s左右，瞬离1000rpm3s；将48孔板置于室温孵育2min；小心撕去八连管盖，将48孔板置于磁力架2min，直至溶液澄清，移取上清27.5µL至新的48孔板中，勿吸磁珠。
5.根据权利要求1所述的基于NGS的SNP分析技术检测脑胶质瘤1p及19q染色体，其特征在于：所述步骤（4）中准备反应体系混匀液，手指轻弹3-5次，上下颠倒混匀2-3次，台式微型离心机瞬离3s，均匀分装至八连管中；在“接头连接产物纯化”这一步中的48孔板中，含27.5μL纯化产物，每孔用八通道移液器P200加入22.5μL反应混匀液，上下吹打10次；贴膜、刮板至紧密贴合；管内无气泡，甩板机离心1000rpm3s；将SPB磁珠上下颠倒2-3次，在VORTEX最大转速下混匀5-10s，使其均一化；在用单通道移液器P...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈永武，
申请(专利权)人：阔然生物医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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