CDKN2A基因表达促进剂制造技术

本发明专利技术公开了一种CDKN2A基因表达促进剂。选自甲基山奈酚、七叶内酯、紫草提取物、山麦冬提取物中的一种或几种。本发明专利技术首次研究CDKN2A基因表达促进剂，筛选到2个化学药剂甲基山奈酚、七叶内酯，以及2个植物提取物药剂紫草提取物、山麦冬提取物，为制备治疗胶质瘤耐药性的药物打下理论基础。药物打下理论基础。药物打下理论基础。

【技术实现步骤摘要】
CDKN2A基因表达促进剂


[0001]本专利技术属于生物基因
，具体涉及CDKN2A基因表达促进剂。

技术介绍

[0002]胶质瘤是成人和儿童最常见的颅内原发性肿瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤。神经胶质瘤具有高复发率和高死亡率的特点，其治疗是神经肿瘤学的重要任务，始终是人们关注的热点，目前胶质瘤的治疗主要以手术切除辅以放、化疗等综合治疗为主，胶质瘤对化疗药物的耐药通常是导致胶质瘤复发的关键因素之一。肿瘤细胞的原发性和获得性耐药是其治疗胶质瘤失败的重要原因，在胶质瘤的治疗过程中，克服耐药是提高胶质瘤患者生存率的关键。参与胶质瘤耐药的机制主要有：多药耐药、DNA损伤修复、肿瘤干细胞的存在和抗凋亡基因的一种或多种机制，明确胶质瘤的耐药机制对临床治疗有指导用药意义，也为抗肿瘤药的研制提供新思路，更为个性化的化疗提供新靶点。
[0003]CDKN2A称为细胞周期依赖性激酶抑制基因或P16INK4，隶属于细胞周期依赖性激酶抑制因子基因家族，是重要的抑癌基因。该基因定位于9p21号染色体，首先由Serrano发现其可与CDK4、CDK6结合，抑制周期素与CDK4结合形成具有激酶活性的复合物，从而阻断该复合物种对RB蛋白的磷酸化，导致细胞增殖停滞于G期，直接参与细胞周期的调控。CDKN2A通过编码细胞周期依赖性激酶抑制蛋白p16NK4a和p14ARF产生作用，P16INK4a主要作用是抑制细胞周期的进程，通过与CyclinD1细胞周期蛋白竞争性结合CDK4/6，抑制相应激酶的活性，阻止正常细胞或肿瘤细胞从G0期进入G1期，同时抑制细胞DNA合成的启动阶段；该基因还可以影响pRB蛋白在细胞周期种对肿瘤细胞增值的影响，pRB在CDK4/6相应激酶激活后，pRB不能进行底物水平磷酸化从而抑制细胞增殖，故CDKN2A基因可能通过影响细胞周期而抑制胶质瘤细胞的增殖。
[0004]研究证明，导入外源性CDKN2A基因后，胶质瘤细胞对卡莫司汀的敏感性增加，说明该基因对胶质瘤的耐药有一定作用，CDKN2A基因参与胶质瘤中细胞周期的调节，在相同药物浓度下可以减慢U251细胞株的迁移，参与克服胶质瘤的耐药，但是，采用导入外源性CDKN2A基因的方法治疗胶质瘤的耐药，技术上实施起来难度特别大，寻找CDKN2A基因表达促进剂，是一个可行的思路，目前还没有CDKN2A基因表达促进剂研究的相关报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种CDKN2A基因表达促进剂。
[0006]一种CDKN2A基因表达促进剂，选自甲基山奈酚、七叶内酯、紫草提取物、山麦冬提取物中的一种或几种。
[0007]优选的所述CDKN2A基因表达促进剂为七叶内酯和紫草提取物。
[0008]一种促进CDKN2A基因表达的细胞培养基，含有甲基山奈酚、七叶内酯、紫草提取物、山麦冬提取物中的一种或几种。
[0009]所述甲基山奈酚或七叶内酯的用量为0.1
‑
2％。
[0010]所述紫草提取物或山麦冬提取物的用量为0.5
‑
4％。
[0011]一种治疗胶质瘤耐药性的药物，含有甲基山奈酚、七叶内酯、紫草提取物、山麦冬提取物中的一种或几种。
[0012]一种促进CDKN2A基因表达的方法，在体内或者体外施用甲基山奈酚、七叶内酯、紫草提取物或山麦冬提取物。
[0013]本专利技术的有益效果：本专利技术首次研究CDKN2A基因表达促进剂，筛选到2个化学药剂甲基山奈酚、七叶内酯，以及2个植物提取物药剂紫草提取物、山麦冬提取物，为制备治疗胶质瘤耐药性的药物打下理论基础。
附图说明
[0014]图1为脑胶质瘤组织样本和正常脑组织样本中CDKN2A蛋白的浓度。
[0015]图2为促进CDKN2A基因表达的化学药剂的筛选结果。
[0016]图3为促进CDKN2A基因表达的植物提取物药剂的筛选结果。
[0017]图4为促进CDKN2A基因表达化学药剂+植物提取物药剂的筛选结果。
具体实施方式
[0018]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0019]实施例1脑胶质瘤与正常脑组织中CDKN2A表达量对比
[0020]采用的脑胶质瘤组织样本32例，正常脑组织样本33例，取自2016年1月
‑
2022年3月在北京大学人民医院就诊、并经手术病理证实为脑胶质瘤的病理标本。世界卫生组织根据组织学和分子特征将中枢神经系统肿瘤分为I至IV分级，本专利技术选用的32例脑胶质瘤组织样本中I级有10例，Ⅱ级有6例，Ⅲ级有8例，IV级有8例；参与本专利技术试验患者，试验均签署知情同意书，并通过医院伦理委员会批准。
[0021]样品总蛋白的提取：
[0022]裂解液制备：每500uL冷的缓冲溶液A中加入2uL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用；
[0023]取100mg组织样本剪碎，加入上述裂解液中，并用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体；
[0024]将组织匀浆吸入另一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm条件下离心5min；
[0025]将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。
[0026]利用多克隆抗体检测试剂盒进行CDKN2A蛋白浓度检测，试剂盒的制备和操作如下：
[0027]包被缓冲液配制：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)，Na2CO
3 16.0g、NaHCO329.0g，蒸馏水溶至1000ml。
[0028]样品/洗涤缓冲液配制：pH7.2的10
×
PBS
‑
Tween 20，Na2HPO4·
12H2O 58g，KH2PO
4 4g，NaCl 100g，KCl 4g，Tween 20 20ml，蒸馏水溶至1000ml。
[0029]酶标记物稀释液配制：10
×
PBS
‑
Tween 20 10ml，FCS(小牛血清)20ml，酶稳定剂
1g，生物防腐剂1ml，蒸馏水溶至1000ml。
[0030]显色剂A配制：柠檬酸35.5g，过氧化脲10g，Tween 20 10ml，蒸馏水溶至1000ml。
[0031]显色剂B配制：柠檬酸120g，EDTA
‑
2Na 1g，TMB
·
2HCl 2g，蒸馏水溶至1000ml。
[0032]终止液配制：2M H2SO4浓硫酸22.2ml，蒸馏水177.3ml，配制时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。
[0033]预包被板的制备：将CDKN2A多克隆抗体溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置24小时，取出，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CDKN2A基因表达促进剂，其特征在于，选自甲基山奈酚、七叶内酯、紫草提取物、山麦冬提取物中的一种或几种。2.根据权利要求1所述CDKN2A基因表达促进剂，其特征在于，为七叶内酯和紫草提取物。3.一种促进CDKN2A基因表达的细胞培养基，其特征在于，含有甲基山奈酚、七叶内酯、紫草提取物、山麦冬提取物中的一种或几种。4.根据权利要求3所述促进CDKN2A基因表达的细胞培养基，其特征在于，所述甲基山奈酚或七叶内酯的用量为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：张瑞，卜令斌，
申请(专利权)人：阔然生物医药科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：