一种肝癌筛查试剂盒及其使用方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种肝癌筛查试剂盒及其使用方法与应用，所述试剂盒包括能够检测ACADS基因甲基化水平的引物和探针：核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的荧光探针；所述试剂盒还包括内参基因ACTB的引物和探针；本发明专利技术还提供了该试剂盒的使用方法，通过对粪便核酸样本进行提取、甲基化转化和使用上述引物和探针进行PCR扩增即可得到检测结果。该试剂盒对于肝癌诊断的灵敏度高、特异性强，能够有效提升肝癌的检出率；且其使用时无创、安全和方便，能够提升受检者的接受程度，有利于扩大肝癌筛查的推广。

A liver cancer screening kit and its application

【技术实现步骤摘要】
一种肝癌筛查试剂盒及其使用方法与应用
本专利技术涉及生物技术及医学领域，具体涉及一种肝癌检测试剂盒及其使用方法与应用。
技术介绍
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命和健康。原发性肝癌主要包括肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)、肝内胆管癌(IntrahepaticCholangiocarcinoma，ICC)和HCC-ICC混合型三种不同病理类型，三者在发病机制、生物学行为、组织学形态、治疗方法以及预后等方面差异较大，其中肝细胞癌占到85％-90％以上。根据Globocan发布的2018年《全球癌症统计报告》，全球肝癌发病841,080例，占同期癌症发病总数的4.7％，分别占同期全球男、女性和合计发病的第6、9和6位；同时，全球因肝癌死亡的人数为781,631例，占同期癌症死亡总数的8.2％，分别占同期全球男、女性和合计发病的第2、6和4位；相比2012年发病率和死亡率略有下降。原发性肝癌的主要类型包括肝细胞癌(HCC)(占75％-85％)和肝内胆管癌(占10％-15％)。肝细胞癌的主要发病风险因素包括慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染、饮酒和肝硬化。肝癌的检测手段主要有血清标志物甲胎蛋白AFP检测、影像学超声US检测、超声造影、穿刺等。甲胎蛋白AFP检测灵敏度低，其灵敏度只有60％左右；影像学超声US检测非常依赖于仪器与人为操作，受医疗资源分布的限制和医生的经验；超声造影和穿刺等检查操作则存在复杂、有创伤和体验差等缺点。临床常用的肝癌筛查方法缺陷明显，综合多种方法仍有可能难以确诊，特别是对于早期的肝癌，临床检查手段很难有效检测。因此，需要开发一种准确度高、便捷和无创的诊断手段辅助诊断肝癌。DNA甲基化通常为甲基基团与5’端胞嘧啶核苷共价结合，是目前研究最深入的表观遗传调控机制之一。DNA甲基化作为一种对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制。DNA甲基化改变在许多肿瘤发生发展过程中发挥重要的作用，可用于肿瘤早期诊断甚至肿瘤亚型的区分。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种肝癌筛查试剂盒，能够通过检测粪便DNA样本中的ACADS基因甲基化水平，用于肝癌的检测与诊断。本专利技术还提出一种非疾病治疗和诊断目的检测ACADS基因甲基化水平的方法。根据本专利技术的第一方面实施例的试剂盒，包括能够检测ACADS基因甲基化水平的试剂。根据本专利技术的第一方面实施例的试剂盒，至少具有如下有益效果：本专利技术的肝癌筛查试剂盒对于肝癌诊断灵敏度高、特异性强，能够有效提升肝癌的检出率，作为无创的检测手段有效补充AFP检测灵敏度特异度不足的缺陷；该试剂盒稳定性好，其检测样本为粪便脱落细胞的DNA，使用时无创、安全和方便，能够提升受检者的接受程度，有利于扩大肝癌筛查的覆盖人群，降低肝癌的发生率。根据本专利技术的一些实施例，所述试剂包括能够检测ACADS基因甲基化水平的引物和探针。根据本专利技术的一些实施例，所述检测ACADS基因甲基化水平的引物包括核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的上游引物和如SEQIDNo.2所示的下游引物，所述探针包括核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的荧光探针。作为优选地，所述核苷酸序列如SEQIDNo.3所示荧光探针的5’端有荧光基团ROX，3’端有荧光淬灭基团BHQ2。根据本专利技术的一些实施例，所述试剂盒中还包括检测内参基因ACTB的内参引物和内参探针。作为优选地，所述内参基因ACTB的内参引物和内参探针包括核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的上游引物和SEQIDNo.5所示的下游引物以及核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的荧光探针。根据本专利技术的一些实施例，所述试剂盒还包括甲基化转化试剂。根据本专利技术的一些实施例，所述试剂盒还包括PCR试剂。根据本专利技术的第二方面实施例的方法，包括以下步骤：S1、提取样本DNA；S2、将步骤S1提取得到的DNA进行甲基化转化得到转化后的DNA模板；S3、将步骤S2的DNA模板使用能够检测ACADS基因甲基化水平的引物和探针进行PCR扩增反应。根据本专利技术的第二方面实施例的方法，至少具有如下有益效果：该试剂盒对于ACADS基因甲基化水平的检测具有灵敏度高和准确度高等优点；该试剂盒使用方法操作简单快速且价格较低，仅需使用PCR扩增技术，能够为没有造影等条件的临床单位提供肝癌筛查手段，有利于肝癌筛查的普及推广，减轻医疗负担与居民经济压力。根据本专利技术的一些实施例，步骤S3中所述能够检测ACADS基因甲基化水平的引物包括核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的上游引物和如SEQIDNo.2所示的下游引物，所述探针包括核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的荧光探针。根据本专利技术的一些实施例，步骤S1中所述样本为粪便样本。根据本专利技术的一些实施例，步骤S3中PCR扩增反应条件为：a.50℃，2min；b.95℃，10min；c.95℃，15s；60℃，30s；荧光采集，45个循环；d.20℃，2min。根据本专利技术的一些实施例，步骤S3中的PCR扩增反应还使用上述内参基因ACTB的内参引物和内参探针。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术实施例6中的试剂盒的灵敏度和特异性测试结果。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施一：采样利用申请人拥有自主专利权的粪便样本保存液(公开号：CN107980763A，实施例中制备的粪便保存试剂)15mL，采集5-8g粪便样本。实施二：提取采用申请人自行研发的磁珠法提取试剂盒(核酸提取或纯化试剂，型号G1201)进行提取，具体步骤如下：1.将收到的样本(约20mL)充分振荡混匀，使样本溶液呈匀浆状态，3000g离心15min，转移10mL上清至另一50mL离心管中，剩余样本保存备用；2.加入10mLLysisBuffer，颠倒混匀，55℃水浴孵育20min；3.加入2mL10％PVPP，垂直混匀仪混匀30min；4.3000g离心8min，将上清液转入新的50mL离心管中；5.加入30μLAcrylCarrier，240μL蛋白酶K，60μL磁珠，垂直混匀仪混匀30min；6.3000g离心3min，将上清倒入废液缸，余留约1.8mL上清；7.将剩余溶液及磁珠充分混匀后，转移至另一2mL低吸附管中，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清；8.加入800μLwashbuffer1，充分振荡混匀，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清；9.加入500μLwashbuffer2，充本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝癌筛查试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能够检测ACADS基因甲基化水平的试剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝癌筛查试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能够检测ACADS基因甲基化水平的试剂。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括能够检测ACADS基因甲基化水平的引物和探针。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测ACADS基因甲基化水平的引物包括核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的上游引物和如SEQIDNo.2所示的下游引物，所述探针包括核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的荧光探针。


4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括检测内参基因ACTB的内参引物和内参探针。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ACTB的内参引物和内参探针包括核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的上游引物和如SEQIDNo.5所示的下游引物以及核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的荧光探针。


6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括甲基化转化试剂。

【专利技术属性】
技术研发人员：王益民，戴应，袁梦兮，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43