猪疾病多联快速检测试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪疾病多联快速检测试纸条及其制备方法。该试纸条采用双抗原夹心法，利用葡萄球菌A蛋白(SPA)作为捕获抗原，分别以酵母表达的猪瘟、蓝耳病、O型口蹄疫病毒主要抗原区(rED)作为检测抗原。本发明专利技术试纸条不需专业人员操作，不需借助任何仪器，检测耗时短且制备简单。采集一份血清样品，可同时检测猪瘟、猪蓝耳病和猪O型口蹄疫病毒抗体。能够满足基层组织、农户对于重大疫病诊断的需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物疫病检测试剂，具体涉及一种可同时检测猪瘟、蓝耳病和O型口蹄疫病毒抗体的免疫层析试纸条，本专利技术还涉及该试纸条的制备方法，属于生物

技术介绍
猪瘟(classical swine fever，CSF)俗称烂肠瘟，是感染猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。猪瘟会导致患病猪发烧、厌食、腹泻、死亡等，可造成母猪流产、仔猪大批死亡。猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)由于发病猪出现耳朵发绀症状，又称蓝耳病。蓝耳病主要感染繁殖母猪和仔猪，引起免疫抑制，对猪链球菌病有诱发作用。口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是一种多宿主传染病，猪、牛、羊等偶蹄类动物最易感。猪O型口蹄疫发病率高，传播迅速，可造成母猪流产、仔猪大批死亡。猪瘟、高致病性猪蓝耳病和口蹄疫是对养猪业危害最严重的三种猪病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病和法定申报动物疫病，我国也将其列为一类传染病。目前，我国针对这三种猪病采取强制免疫与疫情监测相结合的净化策略，疫苗免疫成为影响疫病防控的关键，而针对疫苗建立合适的评价手段具有重要意义。目前，疫苗免疫效果评价主要依赖ELISA方法。国内外有许多动物疫病血清抗体检测试剂，如美国爱德士(IDEXX)和韩国金诺(JBT)的猪瘟阻断ELISA试剂盒，中国兽医药品监察所的猪瘟间接ELISA试剂盒。ELISA敏感性高，可平行检测多份样品，但是该方法耗时较长，间接ELISA需要约2h，阻断ELISA需要2～3h。此外，ELISA检测需要使用酶标仪等仪器，只能适用于具有实验硬件支持的机构，无法在临床一线等简陋条件下开展免疫监测。因此，研发病毒抗体快速检测手段对于猪病临床诊断与免疫监测具有重要意义，而基于免疫
层析原理的胶体金试纸条检测技术操作简单，检测时间短，成为重要的血清学监测手段。目前已有类似专利CN103293306B胶体金检测卡，但是所使用大肠杆菌表达抗原，而原核表达系统缺乏蛋白质折叠的辅助因子，会影响构象抗原表位形成，并最终影响蛋白活性。毕赤酵母表达系统属于真核表达系统，具有完备的蛋白加工修饰机制，且能实现可溶性表达，是免疫学研究的重要工具。猪瘟病毒(CSFV)是一种囊膜病毒，基因组含有一个大的开放阅读框(ORF)，编码一种约3898个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白在翻译加工过程中被蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括C、E0、E1和E2等4种结构蛋白，其中囊膜糖蛋白E2是主要的保护性抗原蛋白。E2蛋白由ORF 5，端的690位氨基酸开始，到1060位氨基酸终止，共含有370个氨基酸，其4个主要的抗原位点均位于N端的690位和866位氨基酸之间。E2蛋白携带猪瘟病毒主要的保护性抗原决定簇，被认为是猪瘟基因工程疫苗和血清学诊断制品研发的重要靶标。蓝耳病病毒(PRRSV)是一种小RNA囊膜病毒，基因组合8个重叠的ORF，其中ORF5-7编码结构蛋白，分别为GP5、M和N蛋白。其中核衣壳蛋白N在免疫保护方面作用不大，但是保守性好、表达量高、抗原性强，是蓝耳病诊断检测的理想靶位。口蹄疫病毒(FMDV)无囊膜结构，衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成。研究表明，O型FMDV表面至少含有5个中和抗原表位，其中最重要的3个表位集中在VP1蛋白。VP1蛋白诱导中和抗体产生，是FMD免疫预防、遗传演化的重要研究对象。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是克服现有技术的不足，提供一种可同时检测猪瘟、蓝耳病、O型口蹄疫病毒抗体的胶体金试纸条。该试纸条不需专业人员操作，不需借助任何仪器，检测耗时短且制备简单。本专利技术试纸条利用葡萄球菌A蛋白(SPA)作为捕获抗原，可同时结合多种疫病病原IgG抗体。此外，本专利技术试纸条分别以酵母表达的猪瘟、蓝耳病、猪O型口蹄疫病毒主要抗原区(rED)为检测抗原，具备特异性高，重复性好的特点。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：一种猪疾病多联快速检测试纸条，试纸条包括底板、包被膜、玻璃纤维膜、吸水纸和样品垫。其中，包被膜的底面粘贴在底板上，包被膜正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸。在玻璃纤维膜远离吸水纸一端的正面粘贴样品垫。在包被膜上设有检测线I、II、III和质控线，检测线I、II、III分别包被猪瘟、蓝耳病、猪O型口蹄疫病毒rED蛋白，质控线包被兔抗猪IgG抗体。所述玻璃纤维膜上喷涂SPA蛋白胶体金颗粒标记偶联物。所述rED蛋白通过酵母表达系统GS115-pGAPZαA表达制备，猪瘟病毒主要抗原区(rED1)来源于E2基因，猪蓝耳病病毒主要抗原区(rED2)来源于N基因，猪O型口蹄疫病毒主要抗原区(rED3)来源于VP1基因。本专利技术试纸条采用双抗原夹心法，当被检样品中含有猪瘟、蓝耳病和猪O型口蹄疫病毒抗体时，则在样品垫处与SPA胶体金颗粒标记偶联物结合，分别形成“SPA偶联物-病毒抗体复合物”，并在吸水纸的作用下向前渗透泳动。当复合物到达检测线I，猪瘟病毒抗体与rED1蛋白发生特异性结合，形成“SPA偶联物-猪瘟病毒抗体-rED1复合物”，在包被膜上出现肉眼可见的色带。当复合物到达检测线II，蓝耳病病毒抗体与rED2蛋白发生特异性结合，形成“SPA偶联物-蓝耳病病毒抗体-rED2复合物”，在包被膜上出现肉眼可见的色带。当复合物到达检测线III，O型口蹄疫病毒抗体与rED3蛋白发生特异性结合，形成“SPA偶联物-口蹄疫病毒抗体-rED3复合物，，，在包被膜上出现肉眼可见的色带。当被检样品中不含猪瘟、蓝耳病、O型口蹄疫病毒抗体时，SPA胶体金颗粒标记偶联物泳动至质控线，与兔抗猪IgG抗体结合，在包被膜上出现肉眼可见的色带。检测时，吸取待检血清样品1滴，加入加样孔，观察检测线I、II、III和质控线是否出现红色色带，从而判定动物体内是否含有猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒和猪O型口蹄疫病毒抗体。本专利技术的积极效果是：1、本专利技术试纸条结合胶体金技术和膜层析技术，操作便捷，不需要仪器，结果判读简单。相对于ELISA，试纸条原辅料更为简单，
成本低，有益于推广应用。采集一份血清样品，可同时检测猪瘟、猪蓝耳病和猪O型口蹄疫病毒抗体。能够满足基层组织、农户对于重大疫病诊断的需求。2、本专利技术采用酵母真核表达系统制备试纸条上的检测用抗原蛋白。酵母为真核表达宿主，蛋白翻译后加工修饰机制更完善，表达蛋白活性高。3、本专利技术采用双抗原夹心法，不受样品的宿主来源限制，除检测猪瘟、蓝耳病和猪O型口蹄疫病毒抗体外，还可用于多种动物O型口蹄疫病毒检测。附图说明图1为本专利技术试纸条的侧面结构示意图。图中1：底板；2：包被膜；3：玻璃纤维膜；4：吸水纸；5：样品垫。图2为图1的正面结构示意图。图中6：检测线I；7：检测线II；8：检测线III；9：质控线。图3为猪瘟病毒主要抗原区(rED1)Western blot鉴定图。图4为蓝耳病病毒主要抗原区(rED2)Western blot鉴定图。图5为O型口蹄疫病毒主要抗原区(rED3)Western blot鉴定图。具体实施方式下面结合附图具体介绍本专利技术的猪疾病多联快速检测试纸条及其制备方法。本领域本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪疾病多联快速检测试纸条，该试纸条包括底板、包被膜、玻璃纤维膜、吸水纸和样品垫；其中，包被膜的底面粘贴在底板上，包被膜正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸；在玻璃纤维膜远离吸水纸一端的正面粘贴样品垫；在包被膜上设有检测线I、II、III和质控线，检测线I、II、III分别包被猪瘟、蓝耳病、猪O型口蹄疫病毒rED蛋白，质控线包被兔抗猪IgG抗体，玻璃纤维膜上喷涂SPA蛋白胶体金颗粒标记偶联物。

【技术特征摘要】
1.一种猪疾病多联快速检测试纸条，该试纸条包括底板、包被膜、玻璃纤维膜、吸水纸和样品垫；其中，包被膜的底面粘贴在底板上，包被膜正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸；在玻璃纤维膜远离吸水纸一端的正面粘贴样品垫；在包被膜上设有检测线I、II、III和质控线，检测线I、II、III分别包被猪瘟、蓝耳病、猪O型口蹄疫病毒rED蛋白，质控线包被兔抗猪IgG抗体，玻璃纤维膜上喷涂SPA蛋白胶体金颗粒标记偶联物。2.根据权利要求1所述的猪疾病多联快速检测试纸条，其中检测线I、II、III和质控线呈平行布置，相邻两线间隔0.4-1.0cm。3.一种猪疾病多联快速检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：(1)将猪瘟、蓝耳病、猪O型口蹄疫病毒rED蛋白、兔抗猪IgG抗体分别用包被缓冲液稀释后形成浓度为1.0-3.0mg/mL的喷涂液；用喷膜仪在包被膜上分别喷涂划线相应喷涂液，形成检测线I、II、III和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，王军，王盼，卜攀攀，吴智坚，王圆圆，柴素真，刘玉辉，李伟豪，曾小宇，苗银萍，余清卫，赵林萍，
申请(专利权)人：郑州中道生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41