本发明专利技术公开了一种经血源性间充质干细胞（ＥＲＣｓ）分离培养及其免疫调节作用。本发明专利技术采用密度梯度离心法从经血中成功分离出ＥＲＣｓ，并对其特异性表面标记及增殖活力进行了检测，建立了该细胞稳定的培养方法，由于来源广泛，取材方便，可以无创伤获取，不涉及伦理问题，为ＭＳＣｓ的临床应用提供了新的替代来源，具有良好的应用前景。同时，经研究还发现，ＥＲＣｓ及培养上清对同源及异源淋巴细胞都具有免疫调节作用，ＥＲＣｓ能显著降低人外周血淋巴细胞ＩＦＮ－γ的分泌。表明ＥＲＣｓ免疫调节作用机制可能与细胞间的直接接触及抑制淋巴细胞ＩＦＮ－γ的分泌有关，为减少异体移植引起的免疫排斥反应及治疗自身免疫系统疾病提供理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及具有自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，尤其是涉及一种经血源性间充质干细胞(ERCs)的分离培养，本专利技术还涉及经血源性间充质干细胞的免疫调节作用。
技术介绍
间充质干细胞(MSCs)具有低免疫原性、多向分化潜能及归巢等优点，是组织工程与细胞移植的重要种子细胞，被广泛应用于心血管疾病、中枢神经系统疾病、骨科类疾病及肾脏疾病等疾病的治疗。异体器官、组织及细胞移植引起的免疫排斥反应及自身免疫性疾病是医学工作者所面临的难题，传统药物等治疗方法无法根治该类疾病并可能引起严重的毒副作用。近年来，一些研究表明骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有独特的免疫调节作用，可用于移植治疗同源异体移植引起的免疫排斥反应及自身免疫性疾病。一些研究发现，MSCs在心脏、肾脏、胰腺、肝脏等多种实体器官移植引起的免疫排斥反应中以及造血干细胞移植导致的移植物抗宿主病(GVHD)中都具有良好的治疗效果，可有效延长移植物生存时间，减轻免疫排斥反应，提高移植成功率。在自身免疫性疾病治疗方面，美国国家卫生部已批准MSCs应用于治疗移植物抗宿主病并进入III期临床阶段。另外在欧洲和北美，MSCs也已被用于治疗一些常见的自身免疫性疾病如全身性硬化症、系统性红斑狼疮等且已进入I/II期临床试验阶段。而骨髓间充质干细胞(BMSCs)的创伤性获取及涉及的伦理、法律等问题又使其应用受到了限制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型MSCs来源的ERCs分离培养，并通过ERCs与植物凝集素(PHA)刺激下人外周血淋巴细胞及小鼠脾淋巴细胞共培养实验及检测免疫相关细胞因子的分泌情况对ERCs的免疫调节作用进行了研究。为实现上述目的，本专利技术可采取下述技术方案：本专利技术所述的经血源性间充质干细胞分离培养，包括下述步骤：第一步：培养基的配制每390ml DMEM高糖培养基加入100ml灭活后的无支原体胎牛血清、5ml10000U/ml的青/链霉素及5ml 0.25mg/ml的两性霉素B，得到体积为500ml的培养基备用；第二步：经血源性间充质干细胞的分离与培养材料获取：取月经血5ml，加入0.2ml 0.25mg/ml的两性霉素B、0.2ml青/链霉素，0.1mlEDTA-Na2防止污染，在材料获取24-48h内进行下述细胞分离；细胞分离：在15ml离心管中缓慢加入5ml比重为1.077的淋巴细胞分离液，将月经血与等量-->PBS缓冲液充分混匀后，将经血用滴管沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液分层液面上，细胞悬液与分离液两者比例为1∶1或2∶1、2000rpm/min水平离心20min；离心后管内液体分为四层，上层为血浆和PBS缓冲液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层交界处有单个核细胞层；用移液器吸取单个核细胞层置入另一15ml离心管中，加入5倍以上体积的PBS缓冲液，1200rpm/min离心10min，洗涤细胞两次；末次离心后，弃上清，用5ml培养基充分混匀后置于T25培养瓶中，于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度培养箱卧式培养，培养瓶标记日期；换液：定期观察细胞生长情况，细胞培养三天后，将培养瓶取出，在100倍目镜下观测细胞贴壁良好，则可进行换液，弃去其它类型杂细胞及未贴壁细胞，根据细胞生长情况，每3-4天全量换液1次；传代：待细胞达到80％～90％融合时，进行传代，贴壁细胞用PBS洗涤2次，再用含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的细胞消化液于37℃消化30秒到1分钟，消化过程中，用倒置显微镜观察细胞消化情况，待细胞大部分胞体回缩、变圆，即加入少量血清终止消化；然后加适量PBS缓冲液，用吸管反复吹打使细胞绝大部分脱落后，将细胞悬液移入15ml离心管，1000r/min，离心5min，弃去上清，后用培养基制成细胞悬液，充分混匀后按1∶3比例传代培养，记为P1代；传代培养过程中每3-4天全量换液一次，贴壁细胞再次融合铺满瓶底后，重复上述操作，记为P2代，以此类推。所述的ERCs及培养上清对同源及异源淋巴细胞还具有免疫调节作用。本专利技术的优点在于采用密度梯度离心法从经血中成功分离出ERCs，并对其特异性表面标记及增殖活力进行了检测，建立了该细胞稳定的培养方法，由于其来源广泛，取材方便，可以无创伤获取，不涉及伦理问题，为MSCs的临床应用提供了新的替代来源，具有良好的应用前景。同时，经研究还发现，ERCs及培养上清对同源及异源淋巴细胞都具有免疫调节作用，ERCs能显著降低人外周血淋巴细胞IFN-γ的分泌。表明ERCs免疫调节作用机制可能与细胞间的直接接触及抑制淋巴细胞IFN-γ的分泌有关，可以为减少异体移植引起的免疫排斥反应及治疗自身免疫系统疾病提供理论依据。附图说明图1为本专利技术采用密度梯度离心分离单核细胞的示意图。图2-1为原代ERCs培养24h后的细胞生长图。图2-2、2-3、2-4分别为第三代ERCs培养1天、3天、5天的细胞生长图。图3为ERCs流式细胞仪分析结果图。图4为ERCs的生长曲线图。图5-1为ERCs对同源及异源淋巴细胞的增殖抑制作用示图。图5-2为ERCs培养上清对T淋巴细胞的增殖抑制作用示图。图6为细胞因子IFN-γ的分泌示图。-->具体实施方式本专利技术所述的经血源性间充质干细胞(ERCs)分离培养，包括下述步骤：第一步：ERCs培养基的配制每390ml DMEM高糖培养基加入100ml灭活后的胎牛血清、5ml 10000U/ml的青/链霉素及5ml 0.25mg/ml的两性霉素B，得到体积为500ml的培养基备用；第二步：ERCs的分离与培养材料获取：取年轻、健康女性月经血5ml，加入0.2ml 0.25mg/ml的两性霉素B、0.2ml青/链霉素，0.1ml EDTA-Na2防止污染，在材料获取24-48h内进行细胞分离；细胞分离：在15ml离心管中缓慢加入5ml比重为1.077的淋巴细胞分离液，将月经血与等量PBS缓冲液充分混匀后，将经血用滴管沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液(聚蔗糖-泛影葡胺分离液，在文章上都直接称为淋巴细胞分离液或Ficoll分离液)分层液面上，细胞悬液与分离液两者比例为1∶1或2∶1，2000rpm/min水平离心20min。离心后管内液体分为四层，上层为血浆和PBS缓冲液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一白色云雾状狭窄带即为单个核细胞层(见图1)；用移液器吸取单个核细胞层置入另一15ml离心管中，加入5倍以上体积的PBS缓冲液，1200rpm/min离心10min，洗涤细胞两次；末次离心后，弃上清，用5ml培养基充分混匀后置于T25培养瓶中，于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度培养箱卧式培养；换液：细胞培养三天后，将培养瓶取出，弃去其它类型杂细胞及未贴壁细胞，每3-4天全量换液1次；传代：待细胞达到80％～90％融合时，进行传代，贴壁细胞用PBS洗涤2次，再用含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的细胞消化液于37℃消化30秒至1分钟，消化过程中，用倒置显微镜观察细胞消化情况，待细胞大部分胞体回缩、变圆，即加入少量血清终止消化；然后加适量PBS缓冲液，用吸管反复吹打使细胞绝大部分脱落后，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种经血源性间充质干细胞分离培养，其特征在于：它包括下述步骤： 第一步：培养基的配制 每３９０ｍｌ ＤＭＥＭ高糖培养基加入１００ｍｌ灭活后的胎牛血清、５ｍｌ １００００Ｕ／ｍｌ的青／链霉素及５ｍｌ ．２５ｍｇ／ｍｌ的两性霉素Ｂ，得到体积为５００ｍｌ的培养基备用； 第二步：经血源性间充质干细胞的分离与培养 材料获取： 取月经血５ｍｌ，加入０．２ｍｌ ０．２５ｍｇ／ｍｌ的两性霉素Ｂ、０．２ｍｌ青／链霉素，０．１ｍｌＥＤＴＡ Ｎａ２防止病原微生物污染，在材料获取２４－４８ｈ内进行下述细胞分离； 细胞分离： 在１５ｍｌ离心管中缓慢加入５ｍｌ比重为１．０７７的淋巴细胞分离液，将经血与等量ＰＢＳ缓冲液充分混匀后，用滴管沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液分层液面上，细胞悬液与分离液两者比例为１∶１或２∶１；２０００ｒｐｍ／ｍｉｎ水平离心２０ｍｉｎ；离心后管内液体分为四层，上层为血浆和ＰＢＳ缓冲液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层交界处有单核细胞层；用移液器吸取单核细胞层置入另一１５ｍｌ离心管中，加入５倍以上体积的ＰＢＳ缓冲液，１２００ｒｐｍ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，洗涤两次；末次离心后，弃上清，用５ｍｌ培养基充分混匀后置于Ｔ２５培养瓶中，于３７℃、体积分数为５％ＣＯ↓［２］、饱和湿度培养箱卧式培养； 换液： 细胞培养三天后，将培养瓶取出，弃去其它类型杂细胞及未贴壁细胞，每３ ４天全量换液１次； 传代： 待细胞达到８０％～９０％融合时，进行传代，贴壁细胞用ＰＢＳ洗涤２次，再用含有０．２５％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ的细胞消化液于３７℃消化３０秒到１分钟，消化过程中，用倒置显微镜观察细胞消化情况，待细胞大部分胞体回缩、变圆，即加入少量血清终止消化；然后加适量ＰＢＳ缓冲液，用吸管反复吹打使细胞绝大部分脱落后，将细胞悬液移入１５ｍｌ离心管，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，弃去上清，后用培养基制成细胞悬液，充分混匀后按１∶３比例传代培养，记为Ｐ１代；传代培养过程中每３－４天全量换液一次，贴壁细胞再次融合铺满瓶底后，重复上述操作，记为Ｐ２代，以此类推。...
【技术特征摘要】
1.一种经血源性间充质干细胞分离培养，其特征在于：它包括下述步骤：第一步：培养基的配制每390ml DMEM高糖培养基加入100ml灭活后的胎牛血清、5ml 10000U/ml的青/链霉素及5ml 0.25mg/ml的两性霉素B，得到体积为500ml的培养基备用；第二步：经血源性间充质干细胞的分离与培养材料获取：取月经血5ml，加入0.2ml 0.25mg/ml的两性霉素B、0.2ml青/链霉素，0.1mlEDTA-Na2防止病原微生物污染，在材料获取24-48h内进行下述细胞分离；细胞分离：在15ml离心管中缓慢加入5ml比重为1.077的淋巴细胞分离液，将经血与等量PBS缓冲液充分混匀后，用滴管沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液分层液面上，细胞悬液与分离液两者比例为1∶1或2∶1；2000rpm/min水平离心20min；离心后管内液体分为四层，上层为血浆和PBS缓冲液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层交界处有单核细胞层；用移液器吸取单核细胞层置入另一15ml离心管中，加入5倍以上体积的PBS缓冲液，120...
【专利技术属性】
技术研发人员：关方霞，周长辉，杨波，周云帆，田毅，谷晨熙，戴建武，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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