业已表明，骨髓细胞可用于在一定时间内持久维持共培养的胰岛β细胞的存活力、结构和/或功能。还发现骨髓细胞在降低炎性细胞因子释放和减少凋亡的同时促进β细胞生长。而且，已表明与骨髓细胞共培养的胰岛细胞保持胰岛素响应功能，并在糖尿病小鼠模型的胰岛细胞移植中起作用，以恢复正常的胰岛素分泌。脐血细胞和分离的外周CD34+血细胞不能支持β胰岛细胞生长或提高存活。
【技术实现步骤摘要】
本申请是2007年11月20日提交的题为“”的PCT / US2007 / 024258号专利技术专利申请的分案申请，原申请进入中国国家阶段获得的国家申请号为200780049872.5。相关申请的参考本申请要求保护2006年11月21日申请的美国临时专利申请序号60 / 860, 637的优先权，该临时专利申请整体在此引入作为参考。关于联邦支持研究的声明本专利技术经国立卫生研究所(NIH)资助号P20RR018757得到美国政府支持。因此，美国政府拥有本专利技术的一定权益。专利
本专利技术一般来说涉及胰岛细胞培养领域。更具体地说，本专利技术涉及骨髓细胞用于在移植前长期培养并可能扩增胰岛细胞的用途。本专利技术还包括在骨髓细胞存在下培养的胰岛细胞在患者中体内替代人胰岛功能的用途。专利技术背景糖尿病是 一个重大且病例不断增长的全球性健康问题[I]。基于标准胰岛素的治疗方案尽管管理血糖水平，但不是治愈性的，患者仍遭受该病的许多长期并发症[2，3]。胰腺移植可治愈该病，但受限于组织可获得性和对免疫抑制疗法的响应[4]。为了保持胰岛细胞的存活力，需要由供体相对快速地收集胰腺。标准移植免疫抑制方案对胰腺移植物并非总是有效。而且，免疫抑制疗法可导致对肾脏的进一步伤害，这常常使需要胰腺移植的患者的功能受损。或者，胰岛β细胞移植可能有效，且几乎不需要猛烈的免疫抑制方案；然而，胰岛细胞的可周性不如胰腺[5]。一次成功的胰岛细胞移植经常需要由2个或3个供体收集细胞，这进一步限制了可通过该方法治疗的个体的数目。分离用于移植的胰岛β细胞也是重要的。在胰岛的分离、储存和运输过程中经历的事件与导致胰岛功能丧失并限制胰岛移植对糖尿病患者的治疗潜力的细胞死亡相关。采用β细胞胰岛移植方案的关键问题涉及在体外或体内难以保持存活的胰岛以及不能通过体外培养扩增胰岛组织。研究已表明，在由供体收获胰腺后尽快进行的由胰腺收获之间没有培养细胞时，胰岛细胞移植是最成功的。不出意料的是，在进行大部分移植的中心的移植也是最成功的。由于这种强有力的培养环境的缺乏，所以用于胰岛细胞移植的供体必须在组织收获时邻近较大的移植中心，受体必须生活在较大的移植中心附近，经常长时间等待一个以上的供体。专利技术概述本专利技术包括持续维持培养中的胰岛β细胞存活力、结构和/或功能的方法。所述方法包括将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养。发现骨髓细胞在降低炎性细胞因子释放和凋亡的同时，促进胰岛β细胞的生长和存活力，并改善β胰岛细胞的功能和形态。已表明胰岛细胞保持胰岛β细胞功能，这通过基础和诱导的胰岛素释放证实。脐血细胞和分离的外周CD34+血细胞不能支持β胰岛细胞生长或增加存活。本专利技术包括将胰岛β细胞与多种骨髓细胞一起培养以扩增培养的胰岛β细胞的方法，其包括降低共培养的凋亡的方法。发现骨髓细胞至少部分通过减少凋亡促进胰岛β细胞生长，也通过增加胰岛β细胞数促进胰岛β细胞生长。扩增胰岛细胞的能力是降低单个受体需要多个供体所必需的，从而潜在地允许广泛应用胰岛β细胞移植。本专利技术包括将胰岛β细胞与多种骨髓细胞一起培养以促进培养中的胰岛聚集的方法。骨髓细胞刺激胰岛聚集的过程。本专利技术进一步包括降低培养胰岛β细胞的细胞因子和其它炎性调节物的释放的方法。所述方法包括将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养。与没有骨髓细胞时培养的胰岛β细胞相比，胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养降低炎性细胞因子如白介素(IL)-1 β的释放。这可能导致患者响应于胰岛β细胞移植的炎性反应下降。本专利技术包括将胰岛β细胞与多种骨髓细胞一起培养以增加内分泌细胞特异性基因(包括胰腺特异性转录因子)的基因表达的方法。所述因子包括内分泌细胞特异性基因GCG (胰高血糖素，α-细胞基因)、INS (胰岛素，β -细胞基因)和SST (促生长素抑制素，Y-细胞基因)；以及β细胞胰腺和十二指肠同源框I转录因子(H)Xl或IPF1)、神经元素3(NGN3)、成对盒基因6(PAX6)、胰岛-1 (ISLl)、v_maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(MAFa)和Misti。所述方法包括将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养。所述方法进一步包括增加NGN3的表达，以增加β细胞再生。所述方法进一步包括通过增加H)X1、IPF1、NGN3、PAX6、ISLl和MAFa中至少一种的表达促进β细胞的长期存活。所述方法还包括通过增加Mistl的表达促进新胰腺组织组织化的方法。本专利技术包括治疗 需要胰岛细胞移植的个体的方法，其包括:获得胰岛β细胞，在骨髓细胞存在下培养胰岛细胞，并将合并的胰岛β细胞和骨髓细胞植入需要治疗的患者中。该方法包括移植骨髓，以通过直接移植在骨髓(优选自体骨髓)存在下培养的胰岛细胞，在需要治疗的患者体内改善和/或替代胰腺细胞功能，改善被降低的或丧失的胰腺细胞功能。需要胰岛β细胞移植的患者可为罹患I型或II型糖尿病的个体。糖尿病可为由于疾病或由于至少部分胰腺切除(如胰腺癌)而损害胰腺引起的。本专利技术可进一步包括选择或鉴定需要胰岛细胞移植或者需要改善或替代胰岛细胞功能的患者。本专利技术还可以包括监测患者的改善的胰腺活性。本专利技术进一步包括实施本专利技术方法的药盒。所述药盒可以包括例如骨髓细胞或如何获得骨髓细胞的说明书，以及如何通过本专利技术的方法培养胰腺细胞的说明书。药盒可进一步包括在骨髓细胞存在下培养胰岛细胞的试剂，或者测定与骨髓细胞一起培养生长的胰岛细胞的存活力、功能和/或特征的试剂。附图简述图1a-1d.有或没有骨髓细胞培养6天或156天的胰岛细胞的相差显微镜检查(图像放大倍数20χ)。图1a显示了单独培养6天的胰岛β细胞。图1b显示了与骨髓细胞一起培养6天的胰岛β细胞。图1c显示了单独培养156天的胰岛β细胞。图1d显示了与骨髓细胞一起培养156天的胰岛β细胞。图2a_c.使用细胞类型特异性标记进行的胰岛β细胞和骨髓细胞的免疫荧光和免疫组织化学分析。图2a显示了采用胰岛素原抗体(由箭头指示)、CD45(骨髓细胞，由细箭头指示)(下图)的荧光免疫组织化学染色和采用DAPI的核染色。图2b显示了对胰岛素原(由粗箭头指示)和CD45(由细箭头指示)的免疫组织化学染色。(图像放大倍数x40)。图2c为柱形图，显示了与第28天的骨髓-胰岛细胞共培养物相比单独的胰岛培养物中的胰岛素原阳性细胞数。(*=p〈0.01，n=6)。图3.在培养153天时使用细胞类型特异性标记进行的胰岛α和β细胞的免疫荧光分析。图像为相差显微镜检查(左图)和在胰岛表面(中图)和中间(右图)的共聚焦显微镜检查。α细胞用胰高血糖素抗体染色(由亮箭头指示)，β细胞用胰岛素原抗体染色(由暗箭头指示)。图4a_b.有或没有骨髓细胞一起生长的胰岛β细胞的功能分析。图4a为经过一系列时间点的基础胰岛素分泌图。图4b为经过一系列时间点一直到第204天响应于高葡萄糖的胰岛素释放图。(*=ρ〈0.01, n=6)。图5a_f.培养胰岛的生长。图5a为测定的示意图。图5b显示了在不存在(上图)或存在(下图)骨髓细胞的情况下于格栅上生长的胰岛。图5c为定量培养胰岛生长的柱形图。(*=ρ〈0.05，n=6)。图5d显示了在新生(左图)或重建(右图，超过13个月)过程中与骨髓细胞一起在栅格上生长的胰岛(放大倍数5x)。图5e为在图5d的右图中显示的胰岛由培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种培养胰岛β细胞的方法，所述方法包括在体外将胰岛β细胞和骨髓细胞一起培养。
【技术特征摘要】
2006.11.21 US 60/8606371.一种培养胰岛β细胞的方法，所述方法包括在体外将胰岛β细胞和骨髓细胞一起培养。2.权利要求1的方法，其中持续培养所述胰岛β细胞一定时间。3.权利要求2的方法，其中所述持续期为至少约30天。4.权利要求2的方法，其中所述持续期为至少约60天。5.权利要求2的方法，其中所述持续期为至少约90天。6.权利要求2的方法，其中所述持续期为至少约120天...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗履广，
申请(专利权)人：罗杰·威廉斯医院，
类型：发明
国别省市：美国;US
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