特异于胰腺胰岛β细胞的蛋白质及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种特异性表达于胰腺胰岛β细胞的ZnT-8蛋白，涉及编码上述的与胰岛素成熟及外排相关的蛋白质的多核苷酸，并涉及它们的应用，例如在分选及研究β细胞和筛选治疗糖尿病和高胰岛素血症的药物上的应用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
特异于胰腺胰岛β细胞的蛋白质及其应用本申请为申请日为2003年11月18日、申请号为200380108886. 1、专利技术名称为“特异于胰腺胰岛β细胞的蛋白质及其应用”的专利技术专利申请的分案申请。本专利技术涉及一种特异表达于胰腺胰岛β细胞的被称为&1Τ-8的蛋白质，涉及编码上述的与胰岛素成熟及外排相关的蛋白质的多核苷酸，并涉及它的应用，特别是在分选及研究β细胞和筛选治疗糖尿病和高胰岛素血症的药物上的应用。糖尿病是最常见的疾病之一，它影响了工业化国家的5%人口并且其发生率在全球所有国家都在持续增加(预计，到2025年将有3亿糖尿病患者，包括法国的240万患者)。 在各种形式的糖尿病中，I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病影响着将近500，000到一百万美国人和150，000法国人，及0. 2到0. 4%人口。特征性的症状包括高水平的血糖和尿糖、 严重的利尿、强烈的饥饿感和乏渴感、以及体重减轻。非胰岛素依赖性II型糖尿病(NIDD)也被称作为“肥胖性”糖尿病或晚期起病糖尿病，常发生于约50岁左右人群。通过饮食、服用口服药物的方式治疗，在疾病进展多年后用胰岛素治疗。目前，有两百万法国人正在接受抗糖尿病药物和/或胰岛素的治疗。尽管通用胰岛素注射及控制糖的摄入可以控制糖尿病，但是目前与该疾病相关的并发症需要新的预防、治疗和诊断糖尿病的方法。胰腺包括两种在形态和生理上都有所不同的结构-外分泌胰腺，它产生参与消化的酶(淀粉酶、脂肪酶等)以及碳酸氢钠。-内分泌胰腺，它产生参与控制血糖的激素(胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽)。内分泌胰腺的细胞被组合成为以小岛形式(朗格汉氏岛或胰岛)分散于胰腺中的微器官。每个胰岛由4种细胞类型所组成α细胞、β细胞、δ细胞和PP细胞。α细胞位于岛的周边并分泌胰高血糖素。β细胞位于岛的中央且是唯一能应答于葡萄糖并分泌胰岛素的细胞。δ细胞位于岛的周边并分泌生长抑素。PP细胞的功能还有争议(合成胰多肽)。研究β细胞的细胞模型的缺乏以及适用于该细胞类型的可靠和有效的细胞分选方法的缺乏都妨碍了对其功能的研究，并因此妨碍了治疗I型和II型糖尿病的新方法的发展。在对糖尿病的治疗中，除规律给予胰岛素外，用于生理地控制高血糖并将糖尿病患者的高血糖正常化的方法之一是恢复细胞的体内胰岛素分泌。在这个方面，已经提出了一些方法一获得动物的产胰岛素细胞进行异种移植；一体外将分离到的干细胞分化为分泌胰岛素的细胞，再移植，以克服免疫的问题及避免患者免疫抑制治疗的需要。但是，通过分化干细胞廉价地生产大量产胰岛素细胞要求特别适用于分型并纯化所分化的细胞的新的生物分子工具；一胰岛移植；近期许多研究的主题都是制备用于治疗目的的胰岛或β细胞。移植的第一步是从已经被宣布为脑死亡的供体中取出胰腺。胰岛的分离从用胶原酶溶液酶消化3胰腺开始。不是所有的移植都要求纯化所消化的胰岛。但是，现在绝大多数研究者都认为纯化胰岛对于同种异体移植是必需的。然后，通过门静脉内注射移植入有效量(最小 3000IEQ/kg)的胰岛(IEQ:胰岛等效量)。但是，分离胰岛或β细胞需要用于选择及鉴定β细胞的特殊及可靠的方法。以往的研究已经尝试发展用于标记β细胞的方法。所提出的方法包括一用GFP (绿色荧光蛋白质)标记，它可荧光标记细胞。这种技术的主要缺点是需要将外源基因或转基因引入到细胞内，更甚者是需使用病毒载体(腺病毒)；一基于β细胞的大量的自体荧光的技术。但是，这个技术缺乏对细胞类型的特异性。一将细胞与锌特异性荧光素(Newport Green 或双硫腙)孵育。这个技术基于β细胞内大量的锌含量。锌是胰岛素分泌颗粒的一种主要成分，另外它在控制胰岛素的分泌上发挥着作用。但是，这些技术有着许多缺点使用化学品、对β细胞的毒性危险、缺乏对细胞类型的特异性。另外，双硫腙有着快速光降解的问题W]；一通过用T细胞克隆(W0 91/17186)对β细胞所表达的抗原的识别来间接验证。 对该抗原的最初研究没有提供肽序列特征的结果，也没有提供对β细胞以及胰岛和胰腺或生物体的其他细胞类型的选择性的结果。相同作者的更新研究显示该抗原有着更广泛的分布，因此该抗原是非特异于β细胞的抗原。因此，缺乏针对胰腺胰岛β细胞的特异及可靠的标记物。本专利技术的一个目的是提供一种这样的标记物。胰岛蓄积了大量的锌，因此为了在分泌囊泡中蓄积锌就需要非常有效及非常特异的转运蛋白。应答于外界刺激例如葡萄糖浓度的增高，通过细胞外排作用将胰β细胞所生成并储存的胰岛素释放到细胞外基质中。葡萄糖的增高引起ATP/ADP比的改变、钾通道的关闭和钙通道的开放，这就引起细胞外排胰岛素。已知在有锌时，胰岛素与锌分别地按4 1和6 2的胰岛素锌比例结合形成四聚体和六聚体。胰岛素以由与按每个六聚体与2个锌原子结合的六聚体所构成的固态形式被储存于分泌囊泡中。囊泡含有比形成胰岛素-锌六聚体所必需量的1到1. 5倍过量的锌。在外排胰岛素期间，富含胰岛素的囊泡与β细胞的细胞膜融合并将胰岛素及锌释放到循环中。所释放的锌作用于钾通道的负反馈环，造成钾通道的活化及细胞外排的终止。在哺乳动物细胞中，已经克隆并描述了 7种具有锌转运蛋白功能的同源蛋白质， 称作为aiT-1、-2、-3、-4、-5、-6和-7。对这些蛋白质一级结构的分析使得确定出一个由 6个跨膜结构域和一个富含组氨酸的细胞内环所构成的共同结构单位成为可能。ZnT-I是一种定位于细胞膜上的遍在的转运蛋白，它保证锌流到细胞外。ZnT-2容许细胞耐受培养基中的过量的锌，从而通过将锌定位于酸性的细胞浆内囊泡中获得对锌的耐受性，因此保证锌在细胞内远高出正常水平的蓄积。已经克隆出人的SiT-3和SiT-4，它们具有与aiT-2相似的功能。ZnT-3特异于某些组织，被强烈地表达于脑部、富含锌的突触囊泡膜、海马的苔状纤维以及睾丸中。ΖηΤ-4被遍在地表达，但是高水平的表达见于脑部和上皮细胞中。这个转运蛋白在哺乳动物的上皮中是重要的，它参与控制母乳中的锌含量。ΖηΤ-5 和ΖηΤ-6也是定位于高尔基体的遍在的转运蛋白。ΖηΤ-7是一种特异地定位于内质网中的遍在的转运蛋白。先前研究提出了一种搜索参与胰腺β细胞的锌代谢的基因的方法。这些研究没有证实一种特异的蛋白质或转运蛋白。本专利技术者已经分离出一个1110个碱基对的多核苷酸(SEQ ID NO. 1)，它代表相应于在胰岛中特异表达的，以及更特异地是在分泌胰岛素的细胞或β细胞中特异表达mRNA 的 cDNA。本专利技术的多核苷酸编码被称为&iT-8(SEQ ID NO. 2)的蛋白质，这是一种369个氨基酸的蛋白质，所估计的分子量为40. 8KDa，具有与ZnT家族蛋白质一级结构同源的一级结构。编码所述蛋白质的基因被称为SiT-8。对完整的SiT-8蛋白质的跨膜电位的研究显示它具有6个跨膜结构域(第74-95、 107-126,141-163,177-196,216-240和246-267位氨基酸)及定位于胞浆内的N和C末端。这个研究也显示该蛋白质二级结构具有3个细胞外氨基酸环(第96-106、164-176和 241-245位氨基酸)。另外，ZnT-8蛋白质在胰岛素分泌囊泡及在细胞膜上的定位说明它参与了锌在含胰岛素囊泡内的蓄积，因此它在胰本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．单克隆或多克隆抗体，其特征在于其特异地识别选自ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：７、８、９和１０的表位。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：米歇尔·塞夫，阿兰·法维耶，
申请(专利权)人：原子能委员会，约瑟夫·傅里叶大学，
类型：发明
国别省市：FR