本发明专利技术公开了一种抗Cry1Ac晶体蛋白兔单克隆抗体的制备方法。它包括高纯度Cry1Ac晶体蛋白作为免疫抗原免疫兔子、多抗血清效价的测定、兔子B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合、以选择性培养基进行选择性培养，经预筛、初筛、复筛过程选择阳性克隆子并大量扩增，构建重组载体并体外培养，分离并纯化获得单克隆抗体。本发明专利技术可用于ELISA，WesternBlotting等免疫学手段对Cry1Ac蛋白的定性或定量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗CrylAc晶体蛋白抗体，尤其涉及一种抗CrylAc晶体蛋白兔单克隆 抗体的制备方法。
技术介绍
据农业生物技术应用国际服务组织(ISAAA)报道，全球共有144项转基因项目， 代表M种作物得到了世界范围的认可，截止到2008年，全世界已经有25个国家种植转基 因作物，同时另有30个国家允许进口转基因作物作为食品和种子。转基因作物中，尤以对 Bt-Cry转基因蛋白的研究最多，CrylAc蛋白是Bt-Cry系列蛋白中的一种。Bt基因是目前 研究应用最为广泛的一种抗虫基因，在防治害虫方面的作用越来越重要。据报道，目前已知 的Bt抗虫基因已达70种，Bt抗虫作物的研究和应用正在高速发展。转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展，也促进了先进科学生产力的发 展。转基因食品虽然能够满足人们对食品营养、产量、抗虫性、甚至药用价值等方面的要求， 但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒 性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因 食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够 快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与 检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护 生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物或者其衍生物中 CrylAc蛋白进行快速的定量或定性分析，研究并得到一株抗CrylAc蛋白的单克隆抗体具 有非常大的意义。兔单克隆抗体较常规的鼠单克隆抗体具有更多优点。首先，兔比鼠能识别更多免 疫抗原的表位抗原决定簇。其次，由于兔脾脏较大，可以进行更多的细胞融合实验，使得高 通量筛选阳性融合细胞成为可能。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗CrylAc晶体蛋白的兔单克隆 抗体的制备方法。抗CrylAc晶体蛋白的兔单克隆抗体的制备方法，的步骤如下1)兔子免疫将40(Γ600μβ的免疫抗原CrylAc蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采 用背部皮下3飞点注射2 3只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用 15(T250mg的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；2)细胞融合选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，8 10天后取无菌 脾脏，制备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为48% 52%的聚乙二醇为融合剂，体积 百分比为189Γ22%的HAT作为选择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为 0. 8 X 10_6 1. 2X10_6mol/L的次黄嘌呤，A是浓度为3. 5X10—9 4. 5X10_9mol/L的氨基蝶呤， T是浓度为1. 4X 10，1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷； 3)杂交瘤细胞的筛选细胞融合后第圹12天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进 行预筛，确定是否需要更换细胞培养液；第15 19天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初 步确定是阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到M孔培养板中传代培养一周； 第2216天通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定3飞株生长状态 最好且表达特异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子_20°C冻存， 经重组获得的细胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养， Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。本专利技术制备的抗CrylAc晶体蛋白兔单克隆抗体可用于ELISAJestern Blotting 等免疫学手段对CrylAc蛋白的定性或定量研究。具体的实施方式 实施例11)兔子免疫将400μβ的免疫抗原CrylAc蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部 皮下3点注射2只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用15(T250mg的 免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；2)细胞融合选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，8天后取无菌脾脏，制备 单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的骨 髓瘤细胞相融合，质量百分比为48%的聚乙二醇为融合剂，体积百分比为18%的HAT作为选 择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为0. 8X 10_6mOl/L的次黄嘌呤，A是浓度 为3. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是浓度为1. 4X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；3)杂交瘤细胞的筛选细胞融合后第8天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进行预 筛，确定是否需要更换细胞培养液；第15天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是 阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到M孔培养板中传代培养一周；第22天 通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定3株生长状态最好且表达特 异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子_20°C冻存，经重组获得的细 胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养，Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。经分析测定，该方法制备的单克隆抗体的免疫学类型为IgG，该方法制备的单克隆 抗体对CrylAc蛋白的亲和常数为2. 58 X ΚΛΤ1，其分子量为150KDa.实施例2 1)兔子免疫将600μβ的免疫抗原CrylAc蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下6点注射3只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用250mg的免疫 抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；2)细胞融合选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，10天后取无菌脾脏，制 备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的 骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为52%的聚乙二醇为融合剂，体积百分比为2 的HAT作为 选择性培养基，铺于40块96孔板中，其中H是浓度为1. 2X 10_6mOl/L的次黄嘌呤，A是浓 度为4. 5X 10_9mol/L的氨基蝶呤，T是浓度为1. 8X 10_7mol/L的胸腺嘧啶核苷；3)杂交瘤细胞的筛选细胞融合后第12天随机选择40板中的2块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进行预 筛，确定是否需要更换细胞培养液；第19天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是 阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到M孔培养板中传代培养一周；第26天 通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定5株生长状态最好且表达特 异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子_20°C冻存，经重组获得的细 胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养，Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。经分析测定，该方法制备的单克隆抗体的免疫学类本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一株抗Ｃｒｙ１Ａｃ晶体蛋白的兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于它的步骤如下：１）兔子免疫 将４００～６００μｇ的免疫抗原Ｃｒｙ１Ａｃ蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合，完全乳化后，采用背部皮下３～６点注射２～３只新西兰大白兔，在开始免疫后的第三、五、七、九周，分别用１５０～２５０ｍｇ的免疫抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合后以同样的方法进行免疫；２）细胞融合 选择第五次免疫之后血清效价高的兔子先进行一次加强免疫，８～１０天后取无菌脾脏，制备单细胞悬浮液，融合当天选择生长旺盛、处于对数生长期的脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞相融合，质量百分比为４８％～５２％的聚乙二醇为融合剂，体积百分比为１８％～２２％的ＨＡＴ作为选择性培养基，铺于４０块９６孔板中，其中Ｈ是浓度为０．８×１０－６～１．２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ的次黄嘌呤，Ａ是浓度为３．５×１０－９～４．５×１０－９ｍｏｌ／Ｌ的氨基蝶呤，Ｔ是浓度为１．４×１０－７～１．８×１０－７ｍｏｌ／Ｌ的胸腺嘧啶核苷；３）杂交瘤细胞的筛选 细胞融合后第８～１２天随机选择４０板中的２块板对克隆子通过间接酶联免疫吸附进行预筛，确定是否需要更换细胞培养液；第１５～１９天通过间接酶联免疫吸附进行初筛，初步确定是阳性的克隆子，并将对应的杂交瘤细胞细胞转移到２４孔培养板中传代培养一周；第２２～２６天通过间接酶联免疫吸附法进行复筛，筛选出阳性克隆，并确定３～５株生长状态最好且表达特异性抗体能力最强的细胞株进入重组载体的构建，其他克隆子－２０℃冻存，经重组获得的细胞株选择一株亲和力和分泌抗体能力强，特异性高的克隆子经体外培养，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ柱分离纯化并得到目标单克隆抗体。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑晓冬，倪庚，沈金儿，刘娜，陆蕾，冯劲松，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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