一种通用的载药系统及制备方法技术方案

一种通用的载药系统及制备方法。本发明专利技术提供了一种升级改造蛋白质或多肽药物的方法，所述方法包括将能与白蛋白特异性结合的抗HSA抗体的VH基因与所述蛋白质或多肽药物基因进行融合表达，从而形成融合蛋白。具体而言，所述方法包括将编码所述蛋白质或多肽的核苷酸序列克隆至BL21/pETa(32+)-HSA基因工程表达载体中，并表达包含保藏号为CCTCC-C2010111的杂交瘤细胞株所产生的抗体的VH片段的融合蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物医药领域，尤其是涉及给药
利用本专利技术的载药系统可以将目前已有的或将来面世的蛋白质或多肽药物进行升级换代，解决目前蛋白质或多肽药物所面临的在体内半衰期较短的难题。本专利技术制备方法简便，适于大规模生产，适于制备目前所有的多肽蛋白类药物。
技术介绍
长期以来蛋白质药物已成功广泛用于临床治疗，许多蛋白质药物为一些疾病提供了有效和独特的治疗效果。然而，由于蛋白质药物本身蛋白质结构的特殊性，人体能非常有效地对进入体内的蛋白质药物进行降解和清除。不同的蛋白质药物由于其分子大小和结构的差异，它们在人体内被降解清除的速率各异1。因此，蛋白质药物在体内的半衰期受制于机体对这种蛋白质的清除降解效应。由于蛋白质药物在体内半衰期短，为了达到有效的治疗效果，往往采用高剂量或多次、长时间用药，这样一方面会增加其毒副作用，同时也给患者用药带来极大的不便。为了延长蛋白质药物在体内的半衰期，从而增强其药物的治疗效果，人们希望能延缓机体对蛋白质药物的降解清除作用。首先有人对蛋白质药物分子本身进行修饰，从而改变机体蛋白质降解清除系统对蛋白质药物的识别和蛋白酶分解作用2_3。例如，为了改善 IFN-α的药代动力学，减少用药频率，有些制药公司将α-干扰素与约12KD或30KD的聚乙二醇(PEG)分子共价结合在一起制备了半合成的α-干扰素药物，称之为聚乙二醇化干扰素(Pegglated IFN)。虽然这种聚乙二醇化干扰素可发挥α -干扰素的抗病毒生物学活性， 并且可显著延长α-干扰素在体内的半衰期。但是这种聚乙二醇化修饰可明显降低α-干扰素的特异性生物学比活性。同时，其半衰期延长的效果也与其结合的聚乙二醇分子的组成和结合位置有关4_5。白蛋白是血浆中的主要蛋白质，它可以与水分子、离子(如Ca2+、Na+和K+)结合，也可以与脂肪酸、激素和药物结合。它的主要功能就是维持血浆胶体渗透压。白蛋白在体内半衰期较长，同时它可以与一些药物分子结合，因此，它是一种理想的药物载体分子。它可对药物分子提供保护作用，避免被机体过早降解清除掉，这样可以延长药物在体内的半衰期。例如，Andersen等人将葡萄球菌G蛋白的白蛋白功能结合区(albumin bindingdomain, ABD)与Fc受体融合在一起组成一融合蛋白。该融合蛋白可与血液中的白蛋白特异性结合，并且FC受体在体内的的半衰期大大延长。将人表皮生长因子受体2 (HER2)与ABD—起制成融合蛋白也有相同的效果6。因此，将生物或化学药物与白蛋白结合在一起可以显著的延长药物在体内的半衰期，从而达到增强药物治疗效果，以及改善药物剂量和病人用药的适应程度。在本专利技术中，我们利用抗人白蛋白的单克隆抗体与白蛋白特异性结合的特点，将蛋白药物与该抗体的特异性白蛋白结合功能区(domains)融合在一起制成融合蛋白。这样将该融合蛋白特异性导向(targetting)与人白蛋白结合，从而达到延长蛋白药物在人体内的半衰期和提高蛋白药物的治疗效果。在该专利技术中我们发现了一株能稳定、高效、特异性地分泌与人白蛋白进行结合的抗体的杂交瘤细胞株(保藏号为CCTCC-C 2010111)。我们经 PCR技术获得其DNA编码序列，再经分子生物学技术构建表达HSA抗体Vh的原核表达工程菌BL21/pETa (32+)-HSA (其保藏号为CCTCC-M 2010288)。我们以该表达载体作为蛋白及多肽类药物的载药系统，首先选择与α 1-干扰素的编码序列进行融合表达，获得表达HSA抗体 Vh 和 IFN 的融合蛋白 BL21/pETa (32+) -IFN-Fab (HSA)，简称 IFN-Fab (HSA)。采用我们独特的生化分离纯化方法从大肠杆菌裂解物中得到高纯度的IFN-Fab(HSA)融合蛋白。体外实验证明该融合蛋白与IFN-α 1有相同的抗病毒作用。将该融合蛋白注射到大鼠体内其半衰期比单用IFN- α 1延长6-12倍。单独IFN- α 1和VH抗体功能区蛋白混合物一起注射不能延长IFN-α 1的半衰期。这说明IFN-Fab(HSA)融合蛋白在具有IFN-α 1的抗病毒生物学活性同时，它在体内的半衰期显著延长，从而其临床治疗作用比IFN-α 1本身有明显的优势。
技术实现思路
本专利技术提供一种新型通用载药系统及其制备方法。本专利技术的技术原理本专利技术利用一种能与正常人体内血浆中的白蛋白结合的基因工程抗体Vh作为载体，制作出一种通用的载药系统。用基因工程手段将目前已有的某些蛋白质或多肽药物进行融合表达，用于蛋白多肽类药物的升级改造，在保证药物药效的同时，可以延长药物在体内的半衰期。本专利技术的技术方案一方面，本专利技术提供了针对人血清白蛋白的抗体Vh片段，其特征在于所述片段是保藏号为CCTCC-C 2010111的杂交瘤细胞株所产生的抗体的Vh片段。保藏号为CCTCC-C 2010111，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉大学，保藏日期2010年 11月10日，分类命名为杂交瘤细胞株1C1。另一方面，本专利技术提供了乂11片段，其特征在于所述片段的氨基酸序列由SEQ IDNO 4所示核苷酸序列编码。再一方面，本专利技术提供了升级蛋白质或多肽药物的方法，其特征在于将能与白蛋白特异性结合的抗体Vh与所述蛋白质或多肽药物进行融合表达，从而形成融合蛋白，优选地，所述能与白蛋白特异性结合的是CCTCC-C 2010111的杂交瘤细胞株所产生的抗体的Vh 片段，更优选地，所述能与白蛋白特异性结合的VH片段由SEQ ID NO :4所示核苷酸序列编码；其中所述的蛋白质或多肽类药物可以是干扰素或其他。另一方面，本专利技术提供了根据上述方法所获得的融合蛋白。另一方面，本专利技术提供了表达融合蛋白的基因工程表达载体，特征在于所述融合蛋白包含保藏号为CCTCC-C 2010111的杂交瘤细胞株所产生的抗人血清白蛋白HSA抗体的 Vh片段，保藏号为CCTCC-C 2010111，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉大学，保藏日期2010年11月10日，分类命名为杂交瘤细胞株1C1，所述载体是BL21/ pETa(32+)-HSA基因工程表达载体(其保藏号为CCTCC-M 2010288)，保藏号为CCTCC-M 2010288，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉大学，保藏日期2010年11 月 10 日，分类命名为 Escherichia coli BL21/pETa(32+)-HAS。另一方面，本专利技术还提供了一种生产蛋白质或多肽的融合蛋白药物的方法，其特征在于所述方法包括将编码所述蛋白质或多肽的核苷酸序列克隆至上述基因工程表达载体中，并表达融合蛋白。首先制备针对人血清白蛋白的单克隆抗体，然后通过基因工程手段扩增获得针对人血清白蛋白抗体的Vh基因序列，将该基因序列克隆到质粒pETa(32+)表达载体，转化至大肠杆菌BL21表达菌，通过筛选获得能特异性分泌针对人HSA抗体Vh蛋白的大肠杆菌 BL21/pETa (32+) -HSA，通过竞争抑制试验、IP等证实该抗体Vh蛋白能特异性与HSA结合；将目前已有的某些蛋白质或多肽药物与BL21/pETa(32+)-HSA进行融合表达，纯化该融合表达蛋白，进行动物试验，比较通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．针对人血清白蛋白的抗体ＶＨ片段，其特征在于所述片段是保藏号为ＣＣＴＣＣ－Ｃ　２０１０１１１的杂交瘤细胞株所产生的抗体的ＶＨ片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：周俊，褚峥，
申请(专利权)人：武汉吉天朋生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：83