利用具有中和VEGFA生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗制造技术

本发明专利技术为利用具有中和VEGFA生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗,提供了抗人VEGF-A单克隆抗体，该抗体能够中和VEGF-A生物学活性，可用于抑制新生血管、尤其是肿瘤新生血管的形成。所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC-C201168的杂交瘤细胞株特异稳定分泌。

【技术实现步骤摘要】
利用具有中和VEGFA生物学活性的McAb应用于肿瘤的靶向治疗
该专利技术属生物技术及生物制药领域。利用具有中和VEGFA生物学活性的单克隆抗体(McAb)应用于肿瘤的靶向治疗，以期达到抑制肿瘤细胞的新生血管生成，从而使肿瘤组织因“饥饿”而死亡。达到靶向治疗各种实体肿瘤的目的，为肿瘤的治疗提供一种新的途径和药物。
技术介绍
目前，研究发现与肿瘤血管生成有关的因子有30余种。其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)也称为血管通透性因子(vascular permeability factor, VPF)及其受体(vascular endothelial growth factor reccptor, VEGFR)能特异地促进细胞分裂、增殖及迁移，在肿瘤新生血管生成过程中起着至关重要的作用。VEGF-A是一种在癌变过程中起重要作用的调控因子，因此VEGF-A可以作为癌症等相关疾病监控的重要指标，也是治疗癌症的重要靶点。肿瘤细胞的生存取决于血管提供营养物质，肿瘤的生长依赖于新血管的形成，因此，理论上，抗血管生成抑制剂会“饿死”肿瘤细胞，从而阻止肿瘤的生长。无论何种组织来源的肿瘤，还是特定的癌基因或抑癌基因的表达，或转移的程度，这个结论均适用。也就是说，抑制肿瘤新生血管形成可广谱地治疗各种类型的肿瘤。
技术实现思路
本专利技术提供了抗人VEGF-A单克隆抗体，该抗体能够中和VEGF-A生物学活性，可 用于抑制新生血管、尤其是肿瘤新生血管的形成。所述单克隆抗体由保藏号为 CCTCC-C201168的杂交瘤细胞株VEGFA1E6(已于2011年8月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉大学，保藏号为CCTCC-C201168)特异稳定分泌产生。体外实验结果显示，该单克隆抗体能抑制VEGF-A诱导HUVEV (人脐静脉细胞株) VEGFR2的磷酸化，抑制HUVEV细胞的生长与增殖、促进HUVEC细胞的凋亡。体内实验结果显示，用该单克隆抗体注射荷瘤小鼠，与对照(仅注射正常小鼠 IgG)相比，注射该单克隆抗体的荷瘤小鼠的生存期明显延长(彡3月，P <0. 05)、瘤体缩小明显(较对照组平均缩小50%以上)或消失。体内体外的实验结果均表明，所述单克隆抗体可用于抑制肿瘤新生血管的形成， 抑制肿瘤的生长，减小肿瘤大小，从而达到治疗肿瘤的目的。因此，一方面，本专利技术还提供了所述单克隆抗体用于抑制肿瘤新生血管形成中的用途。另一方面，本专利技术还提供了所述单克隆抗体用于治疗肿瘤，尤其是恶性肿瘤中的用途。再另一方面，本专利技术提供了所述单克隆抗体在制备用于抑制肿瘤新生血管形成的药物中的用途。再另一方面，本专利技术提供了所述单克隆抗体在制备用于治疗肿瘤、尤其是恶性肿瘤的药物中的用途。在其他方面，本专利技术提供了包含所述单克隆抗体的药物组合物，该药物组合物可用于抑制肿瘤新生血管形成，从而治疗肿瘤、尤其是恶性肿瘤。所述药物组合物可以是注射剂的形式。所述肿瘤优选为乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和肺癌。此外，本专利技术还提供了特异稳定分泌所述单克隆抗体的保藏号为CCTCC-C201168 的杂交瘤细胞株。本专利技术筛选出了一株特异性强，稳定高效分泌具有抗VEGF-A生物学活性的杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体具有抑制VEGF-A生物学活性，应用于肿瘤病人的治疗，为肿瘤的治疗提供一种新的手段和方法。本专利技术采取了以下主要解决的关键技术将本专利技术已成功建立的一株特异性强，稳定高效分泌具有抗VEGF-A生物学活性的杂交瘤细胞株，经基因工程改造技术，制备出重组的人源化具有抑制VEGF-A生物学活性的抗体，应用于肿瘤病人的治疗，为肿瘤的治疗提供一种新的手段和方法。技术路线1.用基因重组的VEGF-A表达蛋白，免疫BALB/C小鼠；2.经PEG 4000将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合； 3.反复进行ELISA及WB进行筛选，建立特异稳定表达抗VEGF-A的杂交瘤细胞株；4.大量扩增，接种小鼠腹腔，制备腹水；5.收集腹水，进行ELISA效价检测、WB检测、增殖抑制试验及抑制VEGF-A诱导 HUVEC细胞VEGFR2磷酸化的生物学活性检测等。利用以上技术路线1-5，本专利技术申请人筛选出了特异稳定分泌小鼠抗人VEGF-A抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CCTCC-C201168。通过体外和体内测试，证实了所述杂交瘤细胞株分泌的抗体可抑制新生血管的形成，从而可用于治疗各种肿瘤，尤其是恶性肿瘤。6.拟以稳定表达具有抗VEGF-A生物学活性的杂交瘤细胞mRNA为模板，小鼠IgV 区简并引物扩增VH及VL。再经重叠PCR技术构建VH-1inker-VL目的片段，最终构建成大肠杆菌BL21/pETa (32+) -VH-1inker-VL基因工程表达菌；经常规发酵扩增、IPTG诱导表达、 破碎、纯化后进行药物的体内外活性及药代学检测。进行中试表达纯化，建立一套可行的生产工艺及规程；申报药物的1、I1、III期临床试验批文，最终获得国家新药生产证书；进行产品宣传并推向市场，应用于临床治疗，为人类健康作出应有的贡献。附图说明图1是对抗人VEGF-A单克隆抗体的特异性鉴定。图2是抗人VEGF-A单克隆抗体(McAb)对HUVEC生长的抑制曲线。横坐标是抗体稀释倍数，纵坐标是抑制率。图3显示了抗人VEGF-A单克隆抗体(McAb)对HUVEC细胞VEGFR2磷酸化的抑制。图4显示了抗VEGF-A单克隆抗体治疗组与非治疗组瘤体的大小对比。图中所显示的瘤体大小是治疗组和非治疗组分别的平均值。图5显示了抗VEGF-A单克隆抗体治疗组与非治疗组的生存期比较结果。图中所示的生存期是治疗组和非治疗组分别的平均值。两者相比，P < O. 05，具有统计学显著差巳具体实施例方式本专利技术由以下实施例来例证，但应当注意的是，以下实施例仅用于例证和解释本专利技术，而不是对本专利技术保护范围的限制。实施例1制备特异性针对VEGF-A的杂交瘤细胞株以重组的人VEGF-A为免疫原。根据常规方法经皮下多点免疫BALB/C小鼠，适时与SP2/0进行经PEG 4000进行融合。按单克隆抗体制备常规进行筛选及亚克隆，获得能高效、稳定分泌特异性抗人VEGF-A的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC-C201168。将该杂交瘤细胞经扩增后接种于已预先用液体石蜡致敏7天的BALB/C小鼠腹腔， 约10 14天收集小鼠腹水用于后续试验研究。腹水经硫酸铵盐析纯化及Protein G-Sepharose 4B亲和层析纯化后(以后简称纯化抗体)检测ELISA效价> 409600。用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人成骨细胞(Hobf)、髓样白血病细胞(K562)的细胞裂解物及重组人VEGF-A为抗原进行western-blot鉴定。结果细胞裂解物均在约40kd 处出现一明显条带，重组人VEGF-A在约20kd处出现一明显条带(结果见图1)。这些结果显示，所述杂交瘤分泌的抗体对VEGF-A具有特异性。 实施例2抗人VEGF-A单克隆抗体对HUVEC生长抑制试验常规收集处于对数生长期HUVEC细胞，用HUVEC专用培养基(含10ng/mlV本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗人VEGF?A单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC?C201168的杂交瘤细胞株特异稳定分泌产生。

【技术特征摘要】
1.抗人VEGF-A单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC-C201168的杂交瘤细胞株特异稳定分泌产生。2.根据权利要求1的抗体,其中所述抗体能够中和VEGF-A生物学活性，用于抑制肿瘤新生血管的形成。...

【专利技术属性】
技术研发人员：周俊，何进军，罗纯，
申请(专利权)人：武汉吉天朋生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：