本发明专利技术涉及生物工程技术领域，公开了一种VEGF的单克隆抗体及包含该抗体的芯片。本发明专利技术所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明专利技术所述单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。包含此抗体芯片可直接应用于医学临床对骨折愈合进行疗效评价，解决了传统技术存在的费时、费力、结果重复性差等技术问题，在临床治疗领域中具有极高的应用价值，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种VEGF单抗及包含该单抗的骨折愈合评价抗体芯片。
技术介绍
血管生成在骨折愈合过程中具有重要意义。新的血管形成可能与诸多因素有关，如成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子。血小板衍生长因子、前列腺素E、血管内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子、胰岛素生长因子I等。血管内皮细胞生长因子(VEGF)对内皮细胞有促进其增殖 和血管生成，增加血管通透性，尤为重要。VEGF通过与血管内皮细胞上的受体结合，具有强大、特异性促血管内皮细胞增生和血管生成作用，是促血管再生的最终通道，其他因子的促血管生成作用是全部或部分通过VEGF的作用得以实现。应用VEGF使骨折端血流量在一定时间内较对照组增高；抗VEGF可导致骨折端血流量明显减少，说明VEGF对骨折端血流量变化可能影响骨折愈合，有重要意义。脑外伤后体液中存在促进骨髓基质干细胞有丝分裂和增殖的细胞因子。其中骨形态发生蛋白(BMP-2)是骨折成功愈合的极重要的因素，然而骨形态发生蛋白似乎并非是脑外伤后骨折愈合加速因素之一；脑外伤后碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)阳性表达提前出现，与血管内皮细胞生长因子(VEGF)有明显的时间和浓度关系，通过血管内皮细胞生长因子的表达促进成骨化；胰岛素生长因子I (IGF- I )在骨折愈合中主要促进软骨的生长；脑源性神经(BDNF)营养因子在骨折愈合各个阶段均有促进作用；血小板衍生因子血清浓度明显低于其他组，作用机制可能是通过血清中胰岛素生长因子II (IGF- II )含量的升高以及局部血小板衍生因子的聚集来完成的，胰岛素生长因子II (IGF- II )血清浓度升高的时间和血小板衍生因子(TOGF)降低的时间均集中在前两周，时间上一致，两者之间可能有协同作用；上皮生长因子(EGF)主要是由炎症细胞单核/巨噬细胞分泌，同时作用于修复细胞成纤维细胞、内皮细胞、表皮细胞等，具有促进细胞增殖的功能。但是，高效价、高特异性的抗人VEGF单克隆抗体及骨折愈合评价抗体芯片目前尚未见到报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种VEGF单抗及包含该抗体的芯片以及应用。本专利技术的整体技术构思是利用自主设计合成的VEGF多肽(序列为IFQEYPDEIEHFKPS)经免疫动物、细胞融合、亚克隆及酶联免疫吸附实验进行特异性筛选技术，获得高效价、高特异性抗人VEGF单克隆抗体，由于此单抗效价高、特异性好，与另外7种与骨折愈合相关的单克隆抗体点制的抗体芯片，结合CY3标记的补体C3抗体与被检产品建立了完整的检测系统，用于检测及评价骨折愈合效果。此抗体芯片具有灵敏度高，特异性好、操作简单、高通量等优点，可用于临床和体检血清的监测和质控。作为优选，所述单克隆抗体包括单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。本专利技术所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP. A-0120694和EP. A. 0125023中描述。本专利技术所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(⑶Rs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP. A. 184187,GB2188638A或.EP. A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本专利技术的单克隆抗体也可用杂交瘤方法制得，因为编码本专利技术人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本专利技术公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本专利技术抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本专利技术的单克隆抗体。如上所述，本专利技术还提供了用于实施本专利技术抗体的试剂、试剂盒或芯片。试剂、试剂盒或芯片至少包括如下一种或多种根据以上方法制成的抗体，编码该抗体的核苷酸，或包含该抗体的真核细胞、原核细胞和病毒以及任选的缓冲溶液。作为优选，本专利技术所述的抗体芯片，还包含特异性结合以下抗原的抗体IGF_1、IGF-2、BMP-2、EGF、PDGF, bFGF、VEGF, BDNF。本专利技术还提供包含所述抗体芯片的试剂盒，还包含信标分子标记的C3补体抗体，所述信标分子优选为CY3。在具体实施方式中，本专利技术还提供VEGF抗体的制备方法，包括如下工艺步骤(I)细胞融合将自主设计合成的VEGF多肽(序列为IFQEYPDEIE HFKPS)免疫动物取其致敏的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞悬液按10-100 1比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国海克隆公司出品)进行细胞培养；(2)筛选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞扩大培养，然后进行抗原特异性免疫组织化学原位测定，选高效价，高特异性的细胞株再扩大培养并冻存；(3)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于I :5000的阳性孔的上清，分别对IGF-I、IGF-2、BMP-2、EGF、PDGF, bFGF、VEGF, BDNF抗原进行特异性和效价筛选。(4)单克隆抗体纯化保存将特异性好和效价高的克隆孔培养液吸出，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将IgG单克隆抗体培养上清溶液在A280nm时收集，I. 44 (吸光单位)浓度为l-10mg/ml。筛选的VEGF杂交瘤细胞株分泌的单抗进行序列分析，其重链可变区如下QVQLV QSGAE VKKPG ASVKV SCKAS GGTFS SYAIS WVRQA PGQGL EWMGG FDPED GETIYAQKFQ GRVTM TEDTS TDTAY MELSS LRSED TAVYY CATGR SMVRG VIIPF NGMDV WGQGT TVTVSSY (如 SEQ ID No. I 所示)其轻链可变区如下DIR MTQSP SSLSA SVGDR V本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种VEGF的单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示；或其重链可变区由SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ？ID？NO.1的氨基酸序列至少有95%的一致性，轻链可变区由SEQ？ID？NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸衍生的与SEQ？ID？NO.2的氨基酸序列至少有95%的一致性且所述单克隆抗体具有特异性结合VEGF的特性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李彬，
申请(专利权)人：李彬，
类型：发明
国别省市：
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