本发明专利技术公开了一种新型抗人血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体。该单克隆抗体对VEGF有很高的亲和力，很低的免疫原性，并且其生物活性有显著提高。本发明专利技术还包含了所述单克隆抗体在研究及诊断治疗方面的应用。本发明专利技术提供的高特异性的人源化VEGF单克隆抗体，所述单抗与阳性药物相比药效更佳且制备工艺简便，成本更低，为癌症以及眼科疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。总之，本发明专利技术积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明专利技术为研究开发该人源化VEGF单克隆抗体，为我国医药市场提供一种性价比更高的治疗药物，因此具有十分广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体药物开发和生产
，具体地，具体地，本专利技术涉及一种人血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体及其制备方法。
技术介绍
血管生成系统在许多疾病发展过程发挥着重要作用，如肿瘤、类风湿性关节炎、增生性视网膜病、牛皮癣。多数实体肿瘤生长是血管依赖性的，如果没有丰富血液供应氧气和营养物质，原发肿瘤不会超过2 3mm3。血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成重要调节因子，是一个血管生成的关键调 节因子，在胚胎发育及出生后的血管发程中均起着极为重要的调节作用，主要参与新生血管的形成VEGF有至少五种不同大小的剪切形式，包括121、145、165、189和206个氨基酸等，其中VEGF121、VEGFi4s和VEGF165是分泌蛋白。VEGF受体包括VEGFRl、VEGFR2和VEGFR3。VEGF与内皮细胞膜上内皮生长因子受体(VGFR)结合后，使VEGFR 二聚体化，受体酪氨酸激酶活性被激活，由受体自身磷酸化后启动下游信号通路如PKC信号通路。VEGF在肿瘤细胞中表达水平显著升高。高表达的VEGF除了能够使血管内皮细胞分化增殖和迁移，促进血管的构建及生长，还能够提高血管的通透性、增加血浆蛋白溶酶激活物(PA)及血浆纤溶酶原激活物抑制剂一 I (PAI-I)的表达，促进肿瘤的侵袭、转移。使用抗体靶向肿瘤特异抗原可以用来治疗肿瘤。鼠移植动物模型鉴定肿瘤抗原分为两种一种是肿瘤特异移植抗原；一种是肿瘤相关移植抗原。肿瘤特异移植抗原是指肿瘤中突变基因编码的蛋白，经过I型MHC被展示到细脆表面。人基因组单个细胞的恶性转化诱因包括化学诱因、放射性诱因和病毒诱因等。在基因组水平，这体现为病毒癌基因、细胞原癌基因、抑癌基因等癌症相关基因的突变。癌症相关基因功能多与细胞复制调控和细胞死亡调控直接相关。诱导细胞复制的原癌基因有编码生长因子和生长因子受体的，例如SiS编码一种血小板来源生长因子，fms、erbB和neu编码生长因子受:体；有编码信号传导通路和转录因子的，例如src编码酪氨酸激酶，ras编码GTP结合蛋白，myc、jun和fos等编码转录因子。抑癌基因能够抑制过度细胞复制，例如Rb基因突变导致retinoblastoma，P53蛋白编码一个核磷酸蛋白。大部分癌症诱导和发展过程是多步骤的。例如人直肠癌发展过程表现出稳定的不同时期特征和依次经历系列的遗传突变。不能有效免疫激活和/或免疫耐受可能是肿瘤晚期无法控制的原因，临床表现为恶性肿瘤形成和原发肿瘤临近淋巴结的肿大。肿瘤相关移植抗原包括肿瘤发展必须蛋白、细胞有丝分裂特异蛋白、肿瘤细胞组织特异性蛋白。血管内皮生长因子(VEGF)是主要的血管内皮生长因子，是恶性肿瘤组织新血管生成所必须的。原位杂交研究表明，许多肿瘤VEGF是过度表达的，包括肺癌、乳腺癌、肾癌、和子宫癌等。Genentech公司生产的VEGF人源抗体Bevacizumab (Avastin)对非小细胞肺癌、直肠癌和乳腺癌均有疗效，其药理是体内注射VEGF抗体特异阻断VEGF的促新血管生成功能，从而抑制恶性肿瘤生长速度。除癌症外，VEGF也是治疗如老年性黄斑变性(AMD)、糖尿病引起的眼底病在内的多种眼科疾病关键。为治疗这类疾病，在Avastin基础上，Genentech又将其全抗体分子结构进行简化，保留能够中和VEGF的抗体片段，同时将给药途径由静脉注射改为玻璃体直接注射，由此推出另一个单抗药物-Lucentis。2006年，Lucenti被美国FDA批准用于治疗老年黄斑变形，很快就成为治疗老年性黄斑病变、糖尿病引起的眼底病的首选药，占领北美市场80%以上的份额。因此，研发一种具有高特征性的人源化VEGF单克隆抗体成为当下的研究热点，更是为满足我国经济困难地区的生物制品用药、癌症治疗的迫切需求
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种人源化VEGF单克隆抗体及其制备方法和用途。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下一种人源化VEGF单克隆抗体，其中重链可变区VH的高变区具有如下氨基酸序列CDRHl(SEQ ID NO. I DYTPTDYQVK),CDRH2(SEQ ID NO. 2 GIDYNFGDTVYNAKFff), CDRH3(SEQ IDNO. 3 WANRTAQW)。本专利技术还提供了优选的VEGF抗体轻链可变区，其中高变区具有下列氨基酸序列CDRLl(SEQ ID NO. 4 :DSSQALLDNDGQTYVN)，CDRL2(SEQ ID NO. 5 :LGSYYNS)，CDRL3(SEQ IDNO. 6 YQGAHPPQT)。本专利技术提供了一种VEGF抗体，其重链可变区具有SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列和序列表I所示核苷酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO. 8所示序列和序列表2所示核苷酸序列，人源化抗体重链可变区具有SEQ ID NO. 9所示序列，轻链可变区具有SEQ ID NO. 10所示序列。本专利技术还提供了抗VEGF单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物，具体地，本专利技术包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本专利技术的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性，较佳地至少95%同源性。抗体的抗原结构特性可由位于重链和轻链可变区的3各特定的区域来描述，成为互补决定区(complementarity determining region, Q)R),将该段间隔成4各框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的⑶R和相应轻链上的⑶R构成了抗体的抗原结合位点。本领域技术人员通过常规方法分析将本专利技术抗体的重链和轻链序列(SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2)，可确定其⑶R区。本专利技术还包括这些⑶R区完全相同的抗体重链和抗体轻链，以及由所述重链和轻链构成的抗体。此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。本专利技术不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体，可用于本专利技术的形成嵌合抗体的技术是本领域公知的，以及抗体与药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶等偶联，组成免疫偶联物。本专利技术还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本专利技术的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可用PRC扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短室。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。获得有关序列后，即可用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本专利技术中所述的“核酸分子本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人源化抗VEGF单克隆抗体，其特征在于：它具有含有如下氨氨基酸序列的三个高变区的重链可变区：CDRH1(SEQ？ID？NO.l：DYTPTDYQVK？GYTFTDYNVA)，CDRH2(SEQ？ID？NO.2：GIDYNFGDTVYNAKFW？DIDPNNGNTIYNQKFK)，CDRH3(SEQ？ID？NO.3：WANRTAQW？YCARGAHW)。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张爱晖，
申请(专利权)人：张爱晖，
类型：发明
国别省市：
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