一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法技术

本发明专利技术涉及在大肠杆菌周质表达重组VEGF抗体片段的纯化制备方法。关键技术是大肠杆菌周质表达VEGF抗体片段的纯化制备工艺和方法。纯化该重组抗体时，周质提取过程中加入可溶性增强试剂，利于抗体重链和轻链的正确折叠，对抗体片段纯化前进行热处理，使部分宿主菌蛋白失活、沉淀，而抗体分子更加稳定。在纯化过程中，仅使用阳离子交换—疏水层析两步法纯化获得纯度大于95%的抗体蛋白，是一种操作简单方便，低成本，高产出，适合产业化的抗体片段纯化制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，提供ー种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法。
技术介绍
单抗药物以其高特异性、有效性和安全性已经成为国际生物技术药物的支柱品种，占到了生物技术药物总额的36%，位居医药生物技术产品前列。2010年，单克隆抗体药物以480亿美元的销售额继续领跑全球药品市场，同比增长20%。2000-2010年十年间全球单克隆抗体药物市场复合增长率高达32%。整个抗体产品市场呈现爆炸式的增长方式，预计在未来十年内单克隆抗体药物将会成为全球生物医药领域发展的主导产品。单抗药物在肿瘤、自身免疫病、心血管及感染性等重大疾病的诊断治疗方面取得了突出的进展，目前FDA批准的治疗性抗体药物的主要靶点有⑶3、⑶11、⑶20、⑶25、⑶33、⑶52、GpIIb/IIIa、呼 吸道合胞体病毒F蛋白、人表皮生长因子受体-2 (Her2)、肿瘤坏死因子alpha (TNF-a ),血管内皮生长因子(VEGF)及表皮生长因子受体(EGFR)等。1989年，Gospodarow从牛垂体滤泡细胞中分离纯化得到ー种蛋白质,能特异作用于血管内皮细胞，引起血管内皮细胞増殖，并在体内诱导血管形成，命名为血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),已证实VEGF是最重要的血管生成因子之一，是特异的内皮细胞促有丝分裂剂。VEGF分子量为46KD，PIた8. 5，对热、酸稳定，人类VEGF基因定位于6号染色体短臂(6p21. 3)上，全长14 kb，由8个外显子和7个内含子组成。因VEGF mRNA剪接方式不同，可产生5种异构体，分别编码121，145，165，189和206个氨基酸，其中VEGF165是主要的效应分子。VEGF是ー种具有内皮细胞特异性的有丝分裂原，体外促进内皮细胞生长，体内诱导血管发生，促进血管生长。VEGF可以强烈地増加毛细血管后静脉和小静脉的通透性。Brock等报道，VEGF是已知的最強的血管渗透剂，高于组胺50000倍。目前认为，VEGF增加血管通透性与血管内皮细胞的渗透细胞器VVO (vascularvacuolar organelle)有大。VEGF的过表达与肿瘤、渗出型年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration, AMD)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)、视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion, RV0)性黄斑水肿、骨髓增生异常性等疾病的发生密切相关，对VEGF单抗药物、反义核苷酸抑制剂、VEGF受体的药物研发成为当前医药领域的研究热点。美国Genetech公司研制的血管表皮生长因子(VEGF)抗体，贝伐单抗(Bevacizumab,商品名Avastin),其通过抑制VEGF,使肿瘤组织无法获得所需的血液、氧和其他养分，以达到抗癌功效。2004年2月FDA批准上市用于治疗转移性结直肠癌和非小细胞肺癌NSCLC —线治疗的VEGF抑制剂，分子量为148 KD。继而Genetech公司开发和生产雷珠单抗(Ranibizumab,商品名Lucentis),其是针对脉络膜新生血管(choroidalnoevascularization , CNV)的VEGF抑制剂，是第二代人源化的抗VEGF重组鼠单克隆抗体片段，由可降低免疫原性的非结合性人源化片段以及鼠高亲和カ抗原决定簇两部分組成。Ranibizumab对人VEGF的所有亚型都具有特异性和亲和力，主要作用机制为结合VEGF165、VEGFl21和VEGF110，阻止血管渗漏和新生血管的形成，从而抑制CNV的生成。2006年6月，FDA批准兰尼单抗用于治疗年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD), 2010年11月增加新的适应症一继发于视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion,RVO)的黄斑水肿。Ranibizumab的分子量为48KD，动物实验表明，玻璃体内注射分子量较大的Bevacizumab不能穿透猴视网膜的内界膜,而注射Ranibizumab则可在I小时内完全渗透视网膜各层，并测得玻璃体内药物的半衰期为3. 2天。Fab片段由重链Fd和完整轻链组成，两者通过一个键间二硫键连接，形成异二聚体。在B细胞的粗面内质网中，可变区立体折叠，链内二硫键形成，从而轻链和重链可变区两个分子间相互作用，形成正确的立体构象。大肠杆菌周质腔有类似于内质网的环境，将重链和轻链5’端连接细菌蛋白的前导肽，在其引导作用下表达的蛋白可以分泌到周质腔，前导肽被前导肽酶特异切割，生成的N末端为天然蛋白的Fd段和轻链在周质腔内完成折叠、形成正确的链内和链间二硫键，成为有生物学活性的Fab片段。Fd基因片段和L链基因可以分别构建在2个载体上，然后共转染细胞，也可以构建在一个载体上转染细胞进行表达。以证明有效地细菌前导肽包括外膜蛋白A(outer membrane protein A, OmpA)、碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase , phoA)、果胶酸盐裂解酶(pectate lyase, pelB)等。使用包涵体方式表达抗体片段，需要在体外进行复性，这一过程对于抗体这样复杂的分子结构效率很低，对重组蛋白的活性有一定影响。传统的抗体和抗体片段的纯化第一步采用亲和色谱(ProteinA、ProteinG、Kappaselect)，在捕获目标蛋白的同时，一步纯化获得纯度比较理想的目标蛋白。但是，在大规模生产的过程中，亲和色谱存在着某些缺陷1、载量低2、配基容易脱落3、价格昂贵4、绝大多数亲和层析介质需要酸性条件下洗脱抗体蛋白，导致某些不耐酸的抗体蛋白聚集、沉淀、活性丧失。亲和配基通过化学键偶联到基质骨架上，在每批纯化过程中存在配基脱落的可能，故而产品需要检测配基残留量；配基脱落造成本身载量不高的介质的动态结合载量进一步降低，为了保证样品的处理量，需要定期补充和更换凝胶，成本递增；亲和介质的价格昂贵，提高产品的生产成本，所以在大规模生产抗体和抗体片段的工艺中，不使用亲和色谱能够快速获取药典纯度要求的重组蛋白，是一种低成本、高效的纯化制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术上的缺陷，提供一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法。纯化该重组抗体时，周质提取过程中加入可溶性增强试剂，利于抗体重链和轻链的正确折叠，对抗体片段纯化前进行热处理，使部分宿主菌蛋白失活、沉淀，而抗体分子更加稳定。大肠杆菌周质表达抗VEGF抗体片段，经过周质提取后的蛋白悬液，纯化前使用热击处理，可使抗体的重链和轻链形成的Fab分子的稳定性提高，同时，去除50%以上宿主菌蛋白和蛋白聚合物，利于下面的纯化。在纯化过程中，使用阳离子交换一疏水层析两步法纯化，快速获得纯度大于95%的抗体蛋白，是一种操作简单方便，低成本、高产出的适合产业化的纯化制备方法。大肠杆菌周质表达的抗VEGF抗体片段的纯化制备方法，包括以下步骤(O菌株构建和目标蛋白表达构建人源化抗血管内皮生长因子Fab噬菌体抗体库，使用VEGF-A为配基进行生物淘选，获得高特异性阳性克隆，测序后对序列进行比对和分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
大肠杆菌周质表达的抗VEGF抗体片段的纯化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）菌株构建和目标蛋白表达：构建人源化抗血管内皮生长因子Fab噬菌体抗体库，使用VEGF？A为配基进行生物淘选，获得高特异性阳性克隆，测序后对序列进行比对和分析；构建适合抗体Fab片段表达的胞周质表达载体，载体元件包括：大肠杆菌启动子、复制子、抗生素筛选标记、多克隆酶切位点、两个核糖体识别位点、两个信号肽序列、两个终止子，分别转录和引导抗体的重链和轻链，引导至周质的轻链和重链在酶的作用下特异切割信号肽，重链和轻链形成N末端是天然氨基酸序列的蛋白，两条链在周质腔的氧化环境中，通过二硫键的配对和形成，最终形成一个具有生物活性的蛋白分子；载体转化大肠杆菌株Rosetta？gami？2（DE3）（黙克公司），筛选阳性菌株，摇瓶法小试筛选高表达菌株，对高表达菌株使用高密度发酵生产抗血管内皮生长因子Fab片段；（2）周质提取：收集发酵菌液进行离心，将菌体细胞重悬于磷酸盐缓冲液，使用剪切机进行剪切至悬液均匀，筛网过滤后加入溶解性增强剂，匀浆在1000bar压力下匀质3？5次，8500rpm，15min离心，上清即为包含Fab单抗的蛋白质溶液；（3）纯化预处理：将包含Fab单抗的蛋白质溶液进行热处理，此过程中出现大量宿主菌蛋白沉淀、絮凝，离心取上清即为初步纯化后的抗体片段；（4）？纯化：使用阳离子交换—疏水介质两步法对表达的抗体进行纯化，SDS－PAGE电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度，蛋白纯度大于95％；（5）超滤：使用Milipore超滤系统，将纯化后的蛋白进行脱盐、更换至抗体稳定的柠檬酸（10mM？？pH5.0）缓冲液系统。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宁，宋磊，赵文明，
申请(专利权)人：山东泉港药业有限公司，
类型：发明
国别省市：