成纤维细胞生长因子的热稳定变体制造技术

本技术涉及经改造的人成纤维细胞生长因子-2（FGF2）蛋白质及其使用方法。特别地，该方法和组合物涉及与野生型蛋白质相比较具有增加的热稳定性的FGF2突变体，和在胚胎干细胞的培养中使用该蛋白质的方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】成纤维细胞生长因子的热稳定变体[00011 本申请是申请日为2012年3月1日，申请号为201280021174.5的、专利技术名称和本发 明相同的专利技术专利申请的分案申请。 相关申请 本申请要求于2011年3月1日提交的美国临时申请61 /448，107的利益，所述美国临时申 请的完整内容通过引用并入本文。 专利
本申请的技术涉及具有增加的热稳定性的经改造的成纤维细胞生长因子-2 (FGF2)，及其用于培养胚胎干细胞的用途。 专利技术背景 人胚胎干细胞一般在含有碱性成纤维细胞生长因子蛋白质的培养基中培养。生长因子 通常以成纤维细胞饲养层的形式或通过使用成纤维细胞条件培养基供应。用重组生长因子 和细胞因子补充此类培养基帮助加强胚胎的和诱导的多能干细胞二者的自我更新和分化。 在这点上，成纤维细胞生长因子_2(FGF2)是人胚胎干细胞培养基的重要组分，因 为它帮助维持细胞处于未分化状态。因此，FGF2的一个功能是延长细胞的多能性时期并且 因此延长其分化成多种不同细胞类型的能力。参见Xu C等人（2005)Stem Cells23:315-323。足够高浓度的FGF2允许在不含成纤维细胞的成纤维细胞非条件培养基中培养人胚胎 干细胞。参见Levenstein ME等人（2006)Stem Cells24:568-574。 然而，当与胚胎干细胞在37°C温育延长的时期时，FGF2在成纤维细胞非条件培养 基中比在成纤维细胞条件培养基中更快速降解。参见Levenstein ME等人（2006)Stem Cells24: 568-574。因此，通常需要每天用新鲜FGF2补充非条件培养基，以便维持培养物中 的有效浓度。从成本角度来看，FGF2在培养物中的短半衰期在工业中尤其是在采用大规模 细胞培养以产生基于干细胞的治疗学的制造方案的背景中构成关注。 专利技术概述 一般而言，本公开内容提供用于培养胚胎干（"ES"）细胞的组合物和方法。具体地，公开 内容提供与野生型FGF2相比较，具有增加的热稳定性的FGF2变体。 在一些实施方案中，组合物包含编码选自下述的多肽的分离多核苷酸：（i)SEQ ID 勵：2的变体或其片段，其包含选自〇651^、〇651、〇65￥川1114川1116、0965和0961'的至少一个 氨基酸置换;和（ii)与SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自 〇651^、〇651、〇65￥、矶114、矶116、0965和0961'的至少一个氨基酸置换。 在一些实施方案中，编码的多肽包含氨基酸置换Q65I、N111G和C96S。在一些实施 方案中，权利要求1的分离多核苷酸，其中编码的多肽包含SEQ ID N0:8。 在另一个方面，公开内容提供包含编码选自下述的多肽的分离多核苷酸的表达载 体：（i)SEQ ID腸：2的变体或其片段，其包含选自〇651^、〇651、〇65￥、价114川1116、0965和 C96T的至少一个氨基酸置换;和（ii)与SEQ ID NO: 2具有至少85%序列同一性的多肽或其片 段，其包含选自0651^、0651、065￥、附1^、附116、〇963和〇961'的至少一个氨基酸置换。在一些 实施方案中，编码的多肽包含氨基酸置换Q65I、N111G和C96S。在一些实施方案中，表达载体 包含编码SEQ ID N0:8的多肽的多核苷酸。在另一个方面，公开内容提供选自下述的分离多肽：（i)SEQ ID N0:2的变体或其 片段，其包含选自0651^、0651、065￥、附1^川1116工963和〇961'的至少一个氨基酸置换；和 与SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自Q65UQ65I、 〇65￥、附114、附116、0963和0961'的至少一个氨基酸置换。在一些实施方案中，多肽包含氨基 酸置换Q65I、N111G和C96S。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID N0:8。 在另一个方面，本公开内容提供用于培养胚胎干细胞的方法，其包括在包含有效 量的权利要求6的多肽的不依赖于饲养细胞的培养基中培养胚胎干细胞，其中所述有效量 包含使细胞维持具有未分化形态至少5传代所需的量。在一些实施方案中，不依赖于饲养细 胞的培养基是hESF9、mTeSRl或STEMPR0?。在一些实施方案中，有效量的多肽是约1.0 ng/μ 1 -约100 ng/μL培养基。在一些实施方案中，胚胎干细胞是人ES细胞、小鼠 ES细胞、牛ES细 胞或猫ES细胞。 在另一个方面，本公开内容提供用于维持人胚胎干细胞处于未分化状态的方法， 其包括使人胚胎干细胞与有效量的包含SEQ ID N0:8的多肽或SEQ ID N0:4的变体接触，所 述多肽或变体包含氨基酸置换Q56I、N92G和C87S。在一些实施方案中，有效量的多肽是约 1.0 ng/μL -约 100 ng/μL培养基。 附图简述 图1:人FGF2(FGF-碱性）A末端前肽是有下划线的，随后为146个氨基酸成熟分泌肽。四 个半胱氨酸以粗体下划线显示。图2:在人细胞中表达的野生型FGF2的SDS-PAGE考马斯染色和蛋白质印迹。图3:具有共同结构的人FGF1 (3F JF;左）和FGF2 (1EV2;右）的X射线晶体结构。图4:人FGF1和FGF2的配对序列比对。四个改造的靶残基是加黑框的。图5(a)-(e) : (a)与其受体结合的人FGF2的X射线晶体结构。所有四个半胱氨酸都 突变为丝氨酸以改善可溶性。改造的靶残基的定位是(13川65、（(：州111、（(1冗78和(6冗96。 图6:来自人细胞的三个经改造的FGF2的表达分析。图7:经由SDS-PAGE考马斯染色显现的QNCm FGF2培养物上清液(左图）和纯化蛋白 质（右图）。纯化蛋白质的抗FGF2蛋白质印迹（中图）。图8:FGF2 QNCm在基于细胞增殖的测定中，显示与野生型FGF2相比较增加的热稳 定性。 图9:FGF2 QNCm(由?表示)在基于细胞增殖的测定中，显示与商购可得的野生型 FGF2 (由表示)相比较增加的活性。图10(a)-(d):(a)良好外观的人ES细胞集落；（b)Nanog启动子（多能性相关基因， 即干细胞基因）的mCherry报道基因。在分化细胞中发现Nanog的丧失或下调；（c)分化干细 胞集落显示"环开；（d)C的mCerry染色。专利技术详述 总则-应当理解本专利技术的特定方面、方式、实施方案、变化和特点在下文以不同详细 水平描述，以便提供本专利技术的基本理解。本公开内容涉及与野生型蛋白质相比较具有增加的热稳定性的经改造的FGF2分 子。经改造的分子在人细胞培养物中具有比野生型蛋白质更长的半衰期，并且更有利于重 组蛋白质在人细胞中的大规模生产。 本专利技术的一个或多个实施方案的细节在下文伴随说明书中阐述。尽管目前描述了 合适方法和材料，但与本文描述那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于本专利技术的实 践或测试中。本专利技术的其他特点、目的和优点从说明书和权利要求书来看将是显而易见的。 一般地，酶促反应和纯化步骤根据制造商的说明书执行。 本文描述的技术和程序一般根据本领域的常规方法和本文件自始至终提供的多 个一般参考文本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码选自下述的多肽的分离的多核苷酸：（i）SEQ ID NO:2的变体或其片段，其包含选自Q65L、Q65I、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换；（ii）与SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性的多肽或其片段，其包含选自Q65L、Q65I、Q65V、N111A、N111G、C96S和C96T的至少一个氨基酸置换。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：SS雍，
申请(专利权)人：人体酶公司，
类型：发明
国别省市：美国;US