【技术实现步骤摘要】
本申请涉及假病毒的包装方法，尤其涉及适宜于转导nk、t细胞等免疫细胞以及干细胞的假病毒的高效包装方法。
技术介绍
1、近年来，以car-t细胞治疗为代表的肿瘤免疫治疗展现了良好的效果及巨大的潜力。不过car在t细胞的表达是影响car-t细胞疗效重要因素之一，随着car-t临床的进展，为了进一步优化car-t疗效，改善免疫微环境、提高cart持续性等方案增加进了car的设计中，对car转导t细胞的能力有了更高的要求。并且随着技术的发展有了通用型细胞治疗产品的需求，已有研究将自然杀伤细胞(nature killer cell后文缩写为“nk”或“nk细胞”)、γδt细胞应用于通用型免疫细胞治疗，但是这一类细胞较传统的t细胞更难进行转导或采用其他方法进行修饰、编辑。除此之外，针对巨噬细胞、dc细胞等固有免疫细胞、干细胞进行基因编辑也越来越被关注，这些细胞同样存在者难于进行遗传操作的现象。
2、以电穿孔技术为代表的非病毒转导技术由于其较高的安全性以及便捷的工艺逐渐得到广泛认可。然而，电穿孔导致的大量细胞死亡阻碍了这一技术的进一步推广。虽然通过电穿孔递送mrna的方法可以有效降低毒性提高细胞活率，但这种转导是瞬时的，不利于car-nk的药效持续性。
3、目前应用成熟的vsv-g(包装有vsv-g(水疱性口炎病毒囊膜糖蛋白)的假型慢病毒)不足以解决上述转导、遗传操作难题，有大量研究表明，vsv-g慢病毒转导nk细胞的效率极低(仅为5～10％)，导致这种现象的原因极有可能是因为nk细胞具有天然的抗病毒能力，同样具有天然
4、专利wo2013/045639a1公布了改造后的包装有狒狒内源性逆转录病毒(baboonendogenous virus，baev)囊膜糖蛋白的慢病毒(baev慢病毒)可以高效转导t细胞及b细胞。虽然baev囊膜糖蛋白(baev-g)具有极高的应用价值，但baev囊膜糖蛋白难以生产出高滴度的假病毒颗粒。目前，用于慢病毒包装的baev囊膜糖蛋主要有两种形式：1、baev-rless，即无融合抑制性r肽(fusion restrictive r peptide)的baev囊膜糖蛋白形式；2、baev/tr，即胞尾结构域替换为mlv囊膜糖蛋白胞尾结构域的baev囊膜糖蛋白形式。baev-rless在293t中表达会使293t形成大量的合胞体，导致细胞大量死亡，严重影响了慢病毒包装。通过293f优化baev-rless慢病毒包装工艺，可在1l体系中生产最多约1e9 tu(elisa测定p24蛋白)的baev-rless慢病毒，但这种工艺产量不稳定，且滴度仍难以满足需求(bauler,m.,etal.,production of lentiviral vectors using suspension cells grown in serum-free media.molecular therapy-methods clinical development,2020.17:p.58-68)。baev/tr形式相对于baev-rless，细胞毒性大大降低，大幅度减少了病毒包装过程中合胞体的出现，但病毒滴度低于baev-rless形式。因此，优化baev囊膜糖蛋白的结构，提高包装的病毒滴度，是baev囊膜糖蛋白能否应用于难转导的工程化免疫细胞、干细胞生产制备的关键。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、为提高囊膜病毒包装滴度，同时保持或进一步提升其对难于转导的免疫细胞或干细胞的转导效率，本申请提供了一种假病毒的包装方法，其中使用的囊膜糖蛋白，以及使用所述方法包装的假病毒。
2、具体地，本申请涉及：
3、1、一种包装假病毒的方法，包含：
4、向靶细胞中导入baev囊膜糖蛋白或包含baev囊膜糖蛋白编码核酸的载体，目的基因编码核酸及病毒包装元件；或
5、构建稳定表达baev囊膜糖蛋白的细胞系，并向所述细胞系导入目的基因编码核酸及病毒包装元件。所述稳定表达baev囊膜糖蛋白的细胞系可以是混合克隆细胞系，也可以经筛选后的单克隆细胞系。
6、2、根据项1所述的方法，其中所述假病毒为慢病毒或其他逆转录病毒。在一些实施方案中，所述慢病毒源自hiv。
7、3、根据项2所述的方法，其中所述目的基因编码核酸为慢病毒或其他逆转录病毒包装系统的转移质粒，所述病毒包装元件是慢病毒或其他逆转录病毒包装系统的包装质粒。
8、4、根据项1-3中任一项所述的方法，其中构建稳定表达baev囊膜糖蛋白的细胞系是通过慢病毒转导或转座将编码baev囊膜糖蛋白的核酸插入靶细胞基因组实现的。
9、5、根据项4的方法，其中所述转座使用的转座子系统选自：pb转座子系统、sb转座子系统、φc31整合酶系统。
10、6、根据项4或5的方法，其中所述慢病毒或其他逆转录病毒转导加入了增感试剂deae或polybrene，或具有与所述deae或polybrene相同有效成分的试剂。
11、7、根据项1-6中任一项所述的方法，其还包含向所述靶细胞或细胞系中导入vsv囊膜糖蛋白或其编码序列，或所述稳定表达baev囊膜糖蛋白的细胞系还稳定表达vsv囊膜糖蛋白。在一些实施方案中，所述vsv囊膜糖蛋白为野生型vsv囊膜糖蛋白或其变体。在一些实施方案中，所述vsv囊膜糖蛋白包含seq id no：18所示的氨基酸序列，或其功能衍生物，或包含与如seq id no：18所示的氨基酸序列具有70％以上序列同一性的氨基酸序列。
12、8、根据项1-7中任一项所述的方法，其中所述baev囊膜糖蛋白的胞尾结构域中蛋白酶切割位点由hiv蛋白酶切割位点取代。
13、9、根据项8所述的hiv蛋白酶切割位点，其氨基酸序列如seq id no：9所示。
14、10、根据项1-9中任一项所述的方法，其中所述baev囊膜糖蛋白包含baev囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、以及morv病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述baev囊膜糖蛋白包含baev囊膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、胞内段近膜区以及morv病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述baev囊膜糖蛋白包含baev囊膜糖蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区、胞内段近膜区以及morv病毒囊膜糖蛋白胞尾结构域。在一些实施方案中，所述baev本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包装假病毒的方法，包含：
2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述BaEV囊膜糖蛋白的胞尾结构域中蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点取代，优选所述的HIV蛋白酶切割位点的氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中所述假病毒为逆转录病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述假病毒为慢病毒，优选HIV病毒。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中转移质粒携带所述目的基因编码核酸，包装质粒携带所述病毒包装元件。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中BaEV囊膜糖蛋白编码核酸通过基因工程方法插入靶细胞基因组构建稳定表达BaEV囊膜糖蛋白的细胞系。
7.根据权利要求6的方法，其中所述基因工程方法为转座，优选所述转座使用的转座子系统选自：PB转座子系统、SB转座子系统或ΦC31整合酶系统。
8.一种用于假病毒包装的BaEV嵌合囊膜糖蛋白或多肽，其胞尾结构域中的蛋白酶切割位点由HIV蛋白酶切割位点替代。
9.由根据权利要求1-7中任
10.根据权利要求9的假病毒用于将外源基因导入细胞中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种包装假病毒的方法，包含：
2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述baev囊膜糖蛋白的胞尾结构域中蛋白酶切割位点由hiv蛋白酶切割位点取代，优选所述的hiv蛋白酶切割位点的氨基酸序列如seq idno：9所示。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中所述假病毒为逆转录病毒。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述假病毒为慢病毒，优选hiv病毒。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中转移质粒携带所述目的基因编码核酸，包装质粒携带所述病毒包装元件。
6.根据权利要求1-...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄宇康，陈运凡，沈俊杰，徐艳敏，洪娟，
申请(专利权)人：重庆精准生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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