本发明专利技术公开了miRNA‑146a及其抑制剂在提高CIK细胞杀伤力方面的应用，miRNA‑146a可以作为药物靶标提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，所述肿瘤细胞为白血病细胞。本发明专利技术发现，miRNA‑146a下调表达的CIK细胞比miRNA‑146a正常表达的CIK细胞具有更高的杀伤力，miRNA‑146a可以作为药物靶标提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力；环状六肽Cyclo(‑Gly‑Thr‑Phe‑Leu‑Tyr‑Ala‑)为miRNA‑146a的有效抑制剂，可以作为miRNA‑146a抑制剂用于提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，天然化合物来源比合成的核苷酸类siRNA具有更高的化学稳定性。
Application of miRNA 146a and its inhibitors in improving CIK cells.
The invention discloses application of miRNA 146a and its inhibitors in improving CIK cell activity, miRNA 146a can be used as drug targets to improve the lethality of CIK cells to tumor cells, the tumor cells of leukemia cells. The present invention found that miRNA than normal 146a expression down-regulation of miRNA expression in CIK cells 146a CIK cells have higher lethality, miRNA 146a can be used as drug targets to improve the lethality of CIK cells to tumor cells; cyclic peptide Cyclo (six Gly Thr Phe Leu Tyr Ala) is effective 146a inhibitor miRNA, miRNA can be used as 146a inhibitors to increase lethality of CIK cells to tumor cells and natural compounds has higher chemical stability than the nucleotides of siRNA synthesis.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫领域，涉及CIK细胞的培养，具体涉及miRNA-146a及其抑制剂在提高CIK细胞杀伤力方面的应用。
技术介绍
随着肿瘤临床治疗的发展，肿瘤免疫治疗方法受到广泛关注。细胞免疫治疗为肿瘤免疫治疗的一种，目的是通过改善患者的免疫系统，达到间接治疗肿瘤的目的。常用于细胞免疫治疗的细胞包括细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞等。其中，CIK细胞是一种经体外诱导培养形成的具有肿瘤细胞杀伤活性的NK样T细胞，其克服了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润细胞(TIL)等细胞增殖能力差、对肿瘤细胞毒性低的缺点，能满足临床治疗的要求[Cytokine-inducedNK-likeTcells:frombenchtobedside.JBiomedBiotechnol,2010]。CIK细胞培养简单，将单个核细胞在体外培养，有序地添加IFN-γ、抗CD3单克隆抗体、IL-1α、IL-2进行诱导，2～3周以后即可收获大量具有强细胞毒性的效应细胞。收获的CIK细胞是异质细胞群，大约95％以上表达CD3+，还含有少量NK细胞。CIK细胞主要的效应群体是一群终末分化的T细胞，细胞表面表达CD3+CD56+。在单个核细胞中，原有CD3+CD56+表达很低；经过体外诱导以后，表达CD3+CD56+的细胞迅速扩增，这些细胞来源于单个核细胞中的CD3+CD56-细胞，是由CD3+CD56-细胞中的CD4-CD8+细胞诱导而来[Characterizationoftherecognitionandfunctionalheterogeneityexhibitedbycytokineinducedkillercellsubsetsagainstacutemyeloidleukaemiatargetcell.Immunology,2009]。CIK细胞的体外增殖能力远优于LAK细胞，在短期培养后即可达到临床所需要的抗肿瘤效应细胞的数量。CIK细胞有广谱的、较强的杀伤肿瘤细胞的作用，对肿瘤细胞的毒性是非MHC限制的，对一些具有耐药性的肿瘤细胞系的毒性也不受影响[CIKcellsfrompatientswithHCCpossessstrongcytotoxicitytomultidrug-resistantcelllineBel-7402/R.WorldJGastroenterol,2005]。CIK细胞对同种自体或者同种异体肿瘤均具有相似的细胞毒性，并且对一般的肿瘤干细胞样细胞也具有细胞毒性[Cytokineinducedkillercellseradicateboneandsoft-tissuesarcomas.CancerRes,2014]。为了提高CIK的毒性和治疗效果，许多研究致力于CIK细胞。
技术实现思路
本专利技术首先提供miRNA-146a作为药物靶标在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用；其次提供miRNA-146a抑制剂或含有该抑制剂的试剂或试剂盒在提高CIK细胞对肿瘤细胞杀伤力中的应用，并提供Cyclo(Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala)作为有效miRNA-146a抑制剂。本专利技术通过如下技术方案得以实现：miRNA-146a作为药物靶标在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞。miRNA-146a抑制剂在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞。进一步地，miRNA-146a抑制剂为环状六肽，结构为Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)。含miRNA-146a抑制剂的试剂或试剂盒在提高CIK细胞对肿瘤细胞杀伤力中的应用。进一步地，所述肿瘤细胞为白血病细胞。进一步地，miRNA-146a抑制剂为环状六肽，结构为Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)。本专利技术优点：本专利技术发现，miRNA-146a下调表达的CIK细胞比miRNA-146a正常表达的CIK细胞具有更高的杀伤力，miRNA-146a可以作为药物靶标提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力；环状六肽Cyclo(-Gly-Thr-Phe-Leu-Tyr-Ala-)为miRNA-146a的有效抑制剂，可以作为miRNA-146a抑制剂用于提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，天然化合物来源比合成的核苷酸类siRNA具有更高的化学稳定性。附图说明图1为抑制组、对照组和阴性对照组CIK细胞miRNA-146a的相对表达量；图2为不同组效应细胞对白血病K562/A02细胞系的杀伤活性；图3为不同组效应细胞对白血病THP-1细胞系的杀伤活性；图4为不同组效应细胞对白血病HL-60细胞系的杀伤活性。具体实施方式为了更好地解释本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：miRNA-146a低表达对CIK细胞杀伤力的影响一、实验材料miRNA-146ainhibitor和inhibitornegativecontrol由上海吉玛制药技术有限公司提供。肿瘤细胞为白血病细胞，包括K562/A02、THP-1及HL-60细胞。其他试剂或仪器均为分子生物学及免疫学常用的试剂或仪器。二、实验方法1、效应细胞CIK的分离培养(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。(2)CIK细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3单抗(50μg/mL)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，连续培养7天，收集细胞备用。2、效应细胞CIK的转染转染试剂为美国Invitrogen公司生产的lipofectamine2000，严格按照使用说明操作。(1)传细胞培养板：以6孔板为例，转染前一天，按1×106/ml密度接种CIK细胞于6孔板，每孔加2ml培养基，使转染时贴壁细胞密度达60％。(2)用DEPC水稀释miRNA-146ainhibitor或inhibitornegativecontrol(NC)，配制终浓度为20μM的存储液，分装使用。(3)配制混合液：miRNA-146ainhibitor或NC混合液：取10μl上述存储液，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液A；lipofectamine2000稀释液：取5μllipofectamine2000，用opti-MEM稀释，轻轻混匀，配制250μl稀释液B。(4)稀释液A和稀释液B室温孵育5分钟后，将二者轻轻混匀，室温孵育20分钟，配制总体积为500μl的稀释液C。(5)将6孔板内原培养基吸去，PBS冲洗1次后吸去，每孔加入1.5mlopti-MEM。将稀释液C加入每本文档来自技高网...
【技术保护点】
miRNA‑146a作为药物靶标在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。
【技术特征摘要】
1.miRNA-146a作为药物靶标在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为白血病细胞。3.miRNA-146a抑制剂在提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤力中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为白血病细胞。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述miRNA-146a抑制剂为一种环状六肽，其结构...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：南京佰泰克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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