本发明专利技术公开了一种增强HIV‑1核酸疫苗免疫原性的佐剂，该佐剂为一种酶解多肽，通过如下方法制备而成：以羊骨为酶解反应的底物，用胰蛋白酶酶解，用超滤膜截留分子量5000‑3000u的组分，冷冻干燥。本发明专利技术酶解多肽可以显著增强HIV核酸疫苗的免疫原性，增强HIV核酸疫苗的体内免疫应答效率，有助于提高HIV核酸疫苗的免疫效果。
An enhanced HIV 1 nucleic acid vaccine immunity adjuvant
The invention discloses an enhanced HIV adjuvant 1 nucleic acid vaccine immunogenicity, the adjuvant is an enzyme polypeptide, is prepared by the following method: with sheep bone enzymatic reaction substrate by trypsin enzymolysis, ultrafiltration membrane with a MWCO of 5000 3000u group. Freeze drying. The enzyme peptide can significantly enhance the immunogenicity of HIV nucleic acid vaccine, enhance the efficiency of HIV nucleic acid vaccine in vivo immune response, and improve the immune effect of HIV nucleic acid vaccine.
【技术实现步骤摘要】
一种增强HIV-1核酸疫苗免疫原性的佐剂
本专利技术属于免疫领域，具体涉及一种增强HIV-1核酸疫苗免疫原性的佐剂。
技术介绍
DNA疫苗具有制作简单、经济、易于储存运输等优点，使其在细菌、病毒、寄生虫等多种疾病的防治与治疗中有很大的潜在应用价值，可能对人类疾病的防治以及畜牧业的健康发展起到划时代的作用。美国FAD已批准乙肝疫苗等几十余种DNA疫苗进入临床试验，显示出DNA疫苗的巨大潜力和应用前景。而由于DNA疫苗的免疫源性较弱的缘故，往往要与佐剂共同使用来增强其作用效果。艾滋病(AIDS)是由艾滋病病毒(HIV)进入机体后，破坏机体的免疫细胞，最终导致机体的免疫能力完全消失，从而引发各类疾病的一种严重传染性疾病。编码HIV逆转录病毒蛋白的基因主要有三种：Env、Pol、Gag。Pol和Gag主要编码病毒的核内蛋白和逆转录酶蛋白，而Env基因主要编码其病毒膜表面的蛋白，并且中和抗体的表位基本都在Env基因上。目前尚无有效的疫苗和药物用于预防和清除感染的HIV病毒。DNA疫苗作为新兴的疫苗，有着传统疫苗无法代替等诸多优点，国内外也将DNA疫苗看作攻克艾滋病的关键技术之一，但目前制约DNA疫苗发展的最大问题是免疫原性不强，因此找到有效的佐剂来增强DNA疫苗的效果迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的缺陷，提供一种酶解多肽作为佐剂来增强HIVDNA疫苗的免疫原性，增强HIVDNA疫苗的体内免疫应答效率。本专利技术通过如下技术方案得以实现：一种酶解多肽，通过如下方法制备而成：以羊骨为酶解反应的底物，用胰蛋白酶酶解，用超滤膜截留分子量5000-3000u的组分，冷冻干燥。优选地，酶解条件为pH值7.8-8.2，酶解温度46-50℃，酶解时间3-5小时。优选地，所述酶解多肽通过如下方法制备而成：将新鲜羊骨用清水洗净，经0.08-0.12MPa高压蒸煮0.5-1.5h使其软化，破碎成1-3cm3的骨粒，置于蒸馏水中，加入胰蛋白酶酶解；酶解结束后，加热使胰蛋白酶灭活，冷却至常温，12000-14000转/分钟离心15-25分钟，取上清，依次用截留分子量为10000u、5000u、3000u的超滤膜进行分级分离，收集截留分子量5000-3000u的组分，冷冻干燥。优选地，胰蛋白酶添加量为底物重量的0.3-0.5％。优选地，酶解条件为pH值8.0，酶解温度48℃，酶解时间4小时。优选地，加热使胰蛋白酶灭活的方法为：在80-90℃条件下水浴8-12分钟。优选地，经0.1MPa高压蒸煮1h使其软化。上述酶解多肽用于HIV-1核酸疫苗佐剂的用途。本专利技术优点：本专利技术酶解多肽可以显著增强HIV核酸疫苗的免疫原性，增强HIV核酸疫苗的体内免疫应答效率(包括体液免疫和细胞免疫)，有助于提高HIV核酸疫苗的免疫效果。附图说明图1为常规IgGELISA分析HIV-1Env特异性体液免疫反应强度。具体实施方式为了更好地解释本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：酶解多肽的制备新鲜羊骨清水洗净后-20℃冷冻保存备用；超滤杯和超滤膜购于上海摩速科学器材有限公司；胰蛋白酶(＞2.5×105U/g)，北京索莱宝科技有限公司。酶解多肽通过如下方法制备而成：将新鲜羊骨用清水洗净，经0.1MPa高压蒸煮1h使其软化，破碎成1-3cm3的骨粒，置于蒸馏水中，加入胰蛋白酶酶解(胰蛋白酶添加量为底物重量的0.4％)，酶解条件为pH值8.0，酶解温度48℃，酶解时间4小时；酶解结束后，在85℃条件下水浴10分钟使胰蛋白酶灭活，冷却至常温，13000转/分钟离心20分钟，取上清，依次用截留分子量为10000u、5000u、3000u的超滤膜进行分级分离，收集截留分子量5000-3000u的组分，冷冻干燥。实施例2：酶解多肽的免疫增强作用一、实验材料酶解多肽按照实施例1方法制备。6-8周龄SPF级雌性Balb/c小鼠，用于免疫评价。二、实验方法1、HIV-1质粒DNA的制备HIV-1质粒为委托广州锐博构建的针对HIV-1CN54膜抗原gp145进行改造后的疫苗质粒，在核酸疫苗载体质粒pVAX1中插入gp145基因，构建成真核表达质粒pVAXGP，已证实可高效表达。将pVAXGP疫苗质粒和pVAX1空白质粒分别转化E.coliDH5a，提取质粒，经酶切测序鉴定为阳性克隆，阳性克隆分别接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃振荡培养15h，次日按1:100扩大培养6h制备发酵培养的种子，最后转入发酵罐中发酵培养，采用大规模碱裂解法提取质粒，并用生理盐水调节浓度至1mg/mL于-20℃保存。2、动物分组和免疫方法Balb/c小鼠随机分为3组，每组10只，分组及处理方法如下：空白质粒组：仅免疫pVAX1空白质粒，50μL/次/只；疫苗质粒组：仅免疫pVAXGP疫苗质粒，50μL/次/只；佐剂辅助组：免疫pVAXGP疫苗质粒+酶解多肽，pVAXGP疫苗质粒50μL/次/只，酶解多肽2mg/kg/次/只。免疫时，肌肉多点注射于小鼠双腿胫骨前肌。分别在第0、2、4周免疫小鼠，第6周处死小鼠检测各项免疫学指标。3、免疫学指标检测3.1INF-γ及IL-2ELISPOT检测特异性细胞免疫反应处死小鼠后获脾淋巴细胞，以CN54Env蛋白的CD8+T细胞优势表位肽(氨基酸序列：CKEVHNVWATHACVPTDPNP，SELYKYKVVEIKPLGIAPTA，QQSNLLRAIEAQQHLLQLTV)刺激24h，BDMouseIFN-γ和IL-2ELISPOT试剂盒检测分泌IFN-γ和IL-2的T淋巴细胞形成斑点数，以评价特异性T淋巴细胞免疫反应水平。3.2结合抗体ELISA及亲和力ELISA检测特异性体液免疫应答用纯度大于95％的HIV-1CN54株真核表达gp120蛋白包被ELISA板(0.01mg/L)，4℃过夜。免疫后血清以1:100为初始稀释度进行倍比稀释，测定吸光度值，滴定至终点以计算抗体几何平均滴度。抗体亲和力ELISA在血清孵育后常温下用0-5mol/L梯度NaSCN竞争结合抗原15min，PBST洗涤10遍，之后IgG-HRP二抗孵育、洗涤、显色等同常规ELISA法。3.3统计学分析使用SPSS20.0统计学软件进行t检验，P<0.05认为差异显著。三、实验结果1、特异性细胞免疫反应处死小鼠获脾淋巴细胞，利用ELISPOT实验分析特异性CD8+T细胞免疫应答。ELISPOT实验结果如下表所示：空白质粒组疫苗质粒组佐剂辅助组SFC/106细胞(INF-γ)＜5225430SFC/106细胞(IL-2)＜53685上述表格可以看出，酶解多肽可以显著提高HIV-1核酸疫苗的特异性细胞免疫应答。2、特异性体液免疫应答免疫后小鼠血清结合抗体ELISA及亲和力ELISA检测特异性体液免疫应答，常规IgGELISA分析HIV-1Env特异性体液免疫反应强度如图1所示；NaSCN竞争ELISA实验可以分析抗原特异性IgG抗体亲和力的变化，以初始血清中IgG的50％滴度为ED50可以评价抗体亲和力，各组抗体亲和力结果如下表所示：空白质粒组疫苗质粒组佐剂辅助组ED50本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酶解多肽，其特征在于，通过如下方法制备而成：以羊骨为酶解反应的底物，用胰蛋白酶酶解，用超滤膜截留分子量5000‑3000u的组分，冷冻干燥。
【技术特征摘要】
1.一种酶解多肽，其特征在于，通过如下方法制备而成：以羊骨为酶解反应的底物，用胰蛋白酶酶解，用超滤膜截留分子量5000-3000u的组分，冷冻干燥。2.根据权利要求1所述的酶解多肽，其特征在于：酶解条件为pH值7.8-8.2，酶解温度46-50℃，酶解时间3-5小时。3.根据权利要求2所述的酶解多肽，其特征在于，通过如下方法制备而成：将新鲜羊骨用清水洗净，经0.08-0.12MPa高压蒸煮0.5-1.5h使其软化，破碎成1-3cm3的骨粒，置于蒸馏水中，加入胰蛋白酶酶解；酶解结束后，加热使胰蛋白酶灭活，冷却至常温，12000-14000转/分钟离心15-25分钟，取上清，...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡攀勇，徐鹏，邓付婷，
申请(专利权)人：南京佰泰克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。