石莼活性多肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了石莼活性多肽的制备方法，具体包括：1）将石莼粉水溶液放入细胞破碎仪内细胞破碎，过滤，将滤液超声波处理，离心；2）离心液中加入不同浓度的(NH4)2SO4，静止，离心；3）将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，在ddH2O中透析，冷冻干燥，即得石莼蛋白；4）将石莼蛋白加水混匀，加胰蛋白酶酶和木瓜蛋白酶酶解，灭酶，冷却，离心；5）将酶解液超滤即得石莼活性多肽。有益效果为：本发明专利技术制备方法工艺简单有效，生产成本低，产量大，适合大规生产；制得的活性多肽具有较强的抗氧化活性，能显著促进人成纤维细胞中胶原蛋白的合成，具有抗皮肤光老化活性的活性。

Method for preparing Ulva polypeptides

The invention discloses a method for preparing Ulva bioactive peptides, including: 1) the Ulva powder solution into cell dissruptor cell crushing, filtration, the filtrate of ultrasonic treatment, centrifugal; 2) with different concentrations of centrifugal liquid in 2SO4 (NH4), static, centrifugal; 3) the salting out sediment dissolved in phosphate buffer solution, dialysis, ddH2O in freeze-drying, namely Ulva protein; 4) the Ulva protein and water mix, plus trypsin and papain, enzyme inactivation, cooling, centrifugal; 5) enzymatic ultrafiltration is Ulva active peptide. The advantages: the preparation method of the invention has the advantages of simple process, low production cost, high yield, suitable for large scale production; the prepared polypeptide has strong antioxidant activity, can significantly promote the synthesis of collagen fibers into cells, with anti photoaging activity.

【技术实现步骤摘要】
石莼活性多肽的制备方法
本专利技术涉及生物制品
，尤其是涉及石莼活性多肽的制备方法。
技术介绍
石莼属绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属，其藻体呈黄绿色，有两层细胞组成的膜状体，边缘宽可达厘米左右。石莼多生长在中、低潮带的岩石上或石沼中，南方种类颜色偏黄，北方种类颜色偏绿，藻体含有多种维生素、麦角固醇，以及酸及丙、丁、戊、十四、十六酸有机酸等。石莼是一种大型海藻，广泛分布于西太平洋沿海。其适温范围0-35℃，适盐范围15-35%，具有很强的生命力和再生力，生长极泼辣，在水质肥沃的内湾生长更为旺盛，是我国野生藻类中资源极为丰富的一种。它不仅藻体鲜艳、味道鲜美，而且富含许多营养物质，具有很高的经济价值。但其在海藻加工工业中的利用价值远不如褐藻和红藻，因而通常作为天然垃圾废弃堆积，造成严重的环境污染和资源浪费。干石莼经过化学分析表明，主要成分有粗纤维、碳水化合物、蛋白质及灰分，并含有少量脂肪，石莼中还含有K、Na、Ca、Mg、Ni、Zn、Mo、Cu等多种微量元素。蛋白质含量较高，一般含量在17～26%之间，不同产地的石莼蛋白质含量不尽相同、另外季节等因素也会对孔石莼中的蛋白质含量产生一定的影响作用，石莼蛋白质中含有丰富的氨基酸，其中有8种为人体必需氨基酸。石莼功用始载于《本草拾遗》，日“石莼生南海，附石而生，似紫菜，色青”，主“味甘无毒，入水，利小便”，《本草纲目》中记载谓“出闽、浙者，大叶似菜”，故也名海青菜，有软坚散结、清热解毒、利水降脂等功效。药理研究表明，石莼在降血脂、降血糖、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化以及克生作用等多方面都显现出了较强的生物活性。石莼可作海菜食用，有清口、解毒、消炎等功效，也可以用于防治中暑、消肿，治喉痛、肠胃炎，除口臭等。现有技术如授权公告号为CN102851345B的中国专利技术专利，公开了小球藻抗肿瘤多肽的制备方法，首先采用低温超高压连续流细胞破碎机提取小球藻蛋白，再用胰蛋白酶水解小球藻蛋白，超滤离心管过滤，获得分子量大小范围为0-3KD、3-5KD、5-10KD以及大于10KD的小球藻多肽。该方法制备的小球藻多肽对人肝癌细胞HepG2体外生长具有一定的抑制作用，有利于抗肿瘤保健食品和医药产品的开发利用，但是制备周期长，小球藻多肽得率低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种活性蛋白肽制备效率高、得率高、纯度高、能耗低、对环境友好的石莼活性多肽的制备方法。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：石莼活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、盐析、透析、蛋白酶解、超滤，具体包括以下步骤：细胞破碎：将石莼粉按1:14-16料液比加水混匀，放入温度4-6℃、流速18-21mL/min、压力110-130MPa、循环2-3次的细胞破碎仪内进行细胞破碎，过滤，将滤液在温度为40-50℃、功率为200-300W的超声波处理25-35min，然后经3-5℃、7000-9000rpm的低温离心机离心18-22min，即得蛋白提取液，该步骤结合细胞破碎仪与超声波进行细胞破壁，不影响蛋白质的活性，能够大大缩短细胞破壁的时间，提高工作效果，可大批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产；盐析：向蛋白提取液中加入(NH4)2SO4至20-25%饱和度，静止15-20min，继续加入(NH4)2SO4至50-55%饱和度，静止15-20min，然后在3-5℃、4000-6000rpm下离心20-25min，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗，且采用不同浓度的硫酸铵溶液，可缩短沉淀时间，效果良好；透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，在ddH2O中透析，更换ddH2O4-6次，袋内溶液冷冻干燥，即得石莼蛋白，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到除去(NH4)2SO4小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；蛋白酶解：将石莼蛋白按1:4-6料液比加水混匀，条件pH至7-8，加1000-1200U/g的胰蛋白酶酶和600-800U/g的木瓜蛋白酶，在45-50℃下酶解6-8h，灭酶，冷却，离心，上清液即为酶解液，该步骤采用双酶酶解法制备石莼活性多肽，利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽，且可使活性肽具有味道鲜美、营养丰富的优点；超滤：将酶解液用分子截留量为3-5KDa的超滤膜超滤，超滤压力为0.2-0.22MPa，即得石莼活性多肽，其氨基酸序列为HSHSVCGYYVSHRGRCYCRCLRCRVLHPGKLCVCVNCSR，该活性多肽具有较强的抗氧化活性，结合细胞代谢中的自由基及过氧化物，防止线粒体的脂质过氧化等，保护细胞抵抗衰老，促进UVB老化的HSF的增殖和胶原蛋白产生的能力，能显著促进人成纤维细胞中胶原蛋白的合成，强化结缔组织，促进细胞活性，从而提升其弹性，减少皱纹，增强光泽与透明度，具有抗皮肤光老化活性的活性，能够延缓皮肤的衰老，可用于化妆品领域。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术提供的石莼活性多肽的制备方法，制备效率高、得率高、纯度高、能耗低、对环境友好，工艺简单有效，生产成本低，产量大，适合大规模制备石莼活性多肽；该制备方法采用的双酶酶解法可利用两种蛋白酶作用的专一性，使原料蛋白质充分水解成活性多肽，提高石莼蛋白质的转化率，使蛋白质尽可能的降解为活性多肽；该提取方法得到的活性多肽具有较强的抗氧化活性，结合细胞代谢中的自由基及过氧化物，防止线粒体的脂质过氧化等，保护细胞抵抗衰老；该活性多肽能促进UVB老化的HSF的增殖和胶原蛋白产生的能力，能显著促进人成纤维细胞中胶原蛋白的合成，强化结缔组织，促进细胞活性，从而提升其弹性，减少皱纹，增强光泽与透明度，具有抗皮肤光老化活性的活性，能够延缓皮肤的衰老，可用于化妆品领域。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：石莼活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、盐析、透析、蛋白酶解、超滤，具体包括以下步骤：1）细胞破碎：将石莼粉按1:15料液比加水混匀，放入温度4℃、流速18mL/min、压力120MPa、循环3次的细胞破碎仪内进行细胞破碎，过滤，将滤液在温度为45℃、功率为200W的超声波处理30min，然后经4℃、8000rpm的低温离心机离心20min，即得蛋白提取液，该步骤结合细胞破碎仪与超声波进行细胞破壁，不影响蛋白质的活性，能够大大缩短细胞破壁的时间，提高工作效果，可大批量化破碎藻细胞，适用于工业化生产；2）盐析：向蛋白提取液中加入(NH4)2SO4至25%饱和度，静止15min，继续加入(NH4)2SO4至55%饱和度，静止20min，然后在4℃、5000rpm下离心25min，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗，且采用不同浓度的硫酸铵溶液，可缩短沉淀时间，效果良好；3）透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，在ddH2O中透析，更换ddH2O5次，袋内溶液冷冻干燥，即得石本文档来自技高网...

【技术保护点】
石莼活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、盐析、透析、蛋白酶解、超滤，其特征在于：所述超滤为：将酶解液用分子截留量为3‑5KDa的超滤膜，在压力为0.2‑0.22MPa下超滤，即得石莼活性多肽。

【技术特征摘要】
1.石莼活性多肽的制备方法，包括细胞破碎、盐析、透析、蛋白酶解、超滤，其特征在于：所述超滤为：将酶解液用分子截留量为3-5KDa的超滤膜，在压力为0.2-0.22MPa下超滤，即得石莼活性多肽。2.根据权利要求1所述的石莼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述超滤中石莼活性多肽的氨基酸序列为HSHSVCGYYVSHRGRCYCRCLRCRVLHPGKLCVCVNCSR。3.根据权利要求1所述的石莼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述细胞破碎为：将石莼粉加水混匀，放入细胞破碎仪内进行细胞破碎，过滤，将滤液超声波处理，离心，即得蛋白提取液。4.根据权利要求3所述的石莼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述细胞破碎中石莼粉与说的料液比为1:4-6。5.根据权利要求3所述的石莼活性多肽的制备方法，其特征在于：所述细胞破碎中细胞破碎仪的参数为：温度为4-6℃，流速为18-21m...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海玲，
申请(专利权)人：舟山富晟食品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33