鱿鱼墨多糖的提取方法技术

本发明专利技术公开了鱿鱼墨多糖的提取方法，其具体步骤为：将鱿鱼墨热水浸提后冷水浸提，离心获得的上清液过超滤膜，即得鱿鱼墨粗多糖提取液；将鱿鱼墨粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶和脂肪酶进行酶解，酶解上清液中加入正丁醇、氯仿和三乙醇胺的混合溶液剧烈搅拌，离心，浓缩后醇沉得鱿鱼墨粗多糖；将鱿鱼墨粗多糖上已活化固相萃取柱，浓缩收集液，然后将浓缩收集液上纤维素离子交换柱，浓缩收集液，透析，冷冻干燥，即得鱿鱼墨多糖。有益效果为：本发明专利技术提取方法简单可行，资源利用率高，提取速率快，提取率高，杂蛋白和色素除去率高，多糖纯度高，不影响多糖活性。

【技术实现步骤摘要】
鱿鱼墨多糖的提取方法
本专利技术涉及鱼类产品深加工
，特别涉及鱿鱼墨多糖的提取方法。
技术介绍
鱿鱼，虽然习惯上称它们为鱼，其实它并不是鱼，而是生活在海洋中的软体动物。鱿鱼属于软体动物门，头足纲，枪乌贼科，通称枪乌贼。体色苍白，体圆锥形，头大，有淡褐色斑，前方生有10条触足，常成群游弋于深约20米的海洋中。常活动于浅海中上层，垂直移动范围达百余米。肉质细嫩，风味类似于鲍鱼，但价格很低，被成为“穷人的鲍鱼”。西方人因为鱿鱼表皮暗且易变，而称鱿鱼为“魔鬼鱼”；西班牙人吃鱿鱼比较多，他们把鱿鱼加工成不同风味的罐头，鱿鱼酱油，鱿鱼圈等；美国人近几年来也开始提倡吃鱿鱼，他们把鱿鱼加工成类似鲍鱼的形态出售；鱿鱼在日本很受欢迎，已成为日本日常生活中必不可少的水产品，日本人把鱿鱼一般加工成冷冻制品、干制品、珍味制品、盐渍制品、加热杀菌制品。鱿鱼加工中产生的副产物，如皮、内脏、眼及墨囊等，都作为废弃物丢掉，不仅造成了环境污染，也不能提高鱿鱼加工的附加值。鱿鱼全身都是宝，鱿鱼皮中含有大量的胶原蛋白，可用来提取胶原蛋白；内脏中含有促进草虾摄饵的氨基酸，粗脂肪（不饱和脂肪酸的含量很高），蛋白质（可用来生产鱿鱼酱油）；墨囊中的墨汁已被证实具有抗菌功能，还有抗肿瘤和增强免疫的功能。鱿鱼的墨汁约占鱿鱼体重的1.28%，是由肉眼看不见的黑色颗粒构成的黏稠的混悬液，其主要化学成分为黑色素和蛋白多糖复合体，但我国对鱿鱼中所含的墨囊或汁的利用未加重视。鱿鱼墨多糖能显著提高免疫低下小鼠的脾脏体重比值、提高血清溶血素含量、增强迟发型变态反应能力、提高腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力和碳廓清能力，进而能提高免疫低下小鼠的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能。现有技术如授权公告号为CN100467061C的中国专利技术专利，公开了一种鱿鱼墨汁多糖的制备方法，步骤如下：按下述重量比：活体冷冻经人工分拣的鱿鱼墨汁1至99.985份、2000u/g食品级脂肪酶0.1至0.005份、100万u/g食品级木瓜蛋白酶0.1至0.001份，对墨汁采用脂肪酶和木瓜蛋白酶在温和条件下进行复合酶水解，滤液中加入95%食用乙醇或化学纯丙酮，使墨汁多糖沉淀，沉淀用去离子水溶解后，回收乙醇或丙酮，干燥后的沉淀用不锈钢粉碎机粉碎即成品鱿鱼墨汁多糖。该制备方法克服了多糖物质具有热不稳性和较小的酸碱稳定性，高温或pH>7或pH<5都会引起多糖的氧化和降解的难题。该方法的分离和提取都是非常简便的，利用鱿鱼墨囊为原料，分离并提取得到符合医药原料要求的鱿鱼墨汁多糖，但是该制备方法多糖的提取率低，水提取多糖的残渣中残留的多糖未提取，造成资源浪费，且得到的多糖中杂蛋白和色素含量较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提取方法简单可行，资源利用率高，提取速率快，提取率高，杂蛋白和色素除去率高，多糖纯度高，不影响多糖活性的鱿鱼墨多糖的提取方法。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：鱿鱼墨多糖的提取方法，包括鱿鱼墨粗多糖提取液制备、初步纯化、固相萃取柱层析、离子交换柱层析，其具体步骤为：鱿鱼墨粗多糖提取液制备：从鱿鱼体内取出墨囊挤出鱿鱼墨，按料液比为1:1.5-2.5向鱿鱼墨中加入蒸馏水，在35-45℃下热水浸提3-5h，然后在0-5℃下继续浸提10-15h，在8000-10000rpm下离心22-28min，获得的上清液过超滤膜，即得鱿鱼墨粗多糖提取液，备用，水提取粗多糖具有条件温和、简单等特点，超滤可以除去小分子无机盐、低聚糖等杂质，不需要采用其他方法，节约生产成本和能耗；初步纯化：将鱿鱼墨粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶和脂肪酶，在pH为6.5-7.5、55-65℃下酶解8-15min，酶解结束后在90-100℃下灭酶10-20min，然后在转速为8000-12000r/min的离心机中离心15-25min，将上清液中加入0.2-0.3倍体积的正丁醇、氯仿和三乙醇胺的混合溶液，剧烈搅拌20-40min，直至除去杂质蛋白，然后在转速为8000-12000r/min的离心机中离心15-25min，再浓缩至原体积的18-25%，再加入3-5倍浓缩液体积的无水乙醇，采用边加入边搅拌的方式，直到沉淀完全析出为止，静置过夜，进行沉淀多糖，然后在转速为8000-12000r/min的离心机中离心15-25min，取沉淀抽滤，无水乙醇、丙酮洗沉淀，即得鱿鱼墨粗多糖，脂肪和蛋白质的存在不仅会影响鱿鱼墨多糖的纯度，还会影响鱿鱼墨多糖的理化性质、结构及活性，因此除去蛋白质是多糖提取过程中一个必不可少的环节，该步骤结合酶法和正丁醇、氯仿、三乙醇胺方法，能使鱿鱼墨粗多糖中的脂肪被水解成甘油和脂肪酸、蛋白质被水解成氨基酸和低分子肽，进而可初步除去脂肪和蛋白质，同时能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，并保证多糖的存在，有效的降低了多糖的损失率；固相萃取柱层析：按料液比为1:4-6（g/mL）向鱿鱼墨粗多糖中加入超纯水，在70-90℃下加热溶解20-30min，然后在转速为4000-6000r/min的离心机中离心3-8min，沉淀物重复上述操作2-3次，合并上清液，上已活化的固相萃取柱，用超纯水洗柱2-4个柱体积，浓缩收集液，备用，鱿鱼墨粗多糖中含有较多色素杂质，如果直接上色谱柱容易堵塞填料，很难继续上样，增加了分离纯化的难度，该步骤可除去鱿鱼墨粗多糖中的色素，利于后续试验的顺利进行，且该方法使得多糖的损失率较低；离子交换柱层析：将浓缩收集液上DEAE-52纤维素离子交换柱，上样后，依次用0-2mol/L的NaCl溶液分段梯度洗脱，控制流速为1-2mL/min，自动部分收集器收集，直至无糖检出，浓缩收集液，经6000-10000Da透析袋透析48h，冷冻干燥，即得鱿鱼墨多糖。作为优选，正丁醇、氯仿和三乙醇胺的混合溶液中正丁醇、氯仿和三乙醇胺的体积比为1:0.2-0.3:0.02-0.03，该混合溶液中正丁醇、氯仿和三乙醇胺的合理比例，能够使混合溶液中的各组分达到增益效果，不仅能够有效的脱除多糖液中游离及酶解的蛋白质，使蛋白质的去除率达到最高，且能大大降低处理形成的凝胶物中夹带有多糖物质，并保证鱿鱼墨多糖的结构，避免多糖和蛋白质结合形成糖蛋白发生凝聚沉淀，大大降低了多糖的损失率。作为优选，固相萃取柱中的填料为微波改性活性炭，其制备方法为：将活性炭置于浓度为3-6%的盐酸溶液中煮沸，并保持40-50min，滤去水分后用去离子水反复冲洗至中性，接着在100-120℃下烘干20-30h，然后将活性炭在微波功率为600-700W的条件下微波辐射4-6min，即得改性活性炭，上述盐酸溶液中含有0.021-0.025%的马兜铃酸，用含有马兜铃酸的盐酸溶液预处理活性炭，可使活性炭中的杂质在微波处理时能够不被晶化，不会造成活性炭微晶层间距变小，且可避免活性炭基本微晶发生热膨胀而造成孔隙塌的现象，保障活性炭的吸附效果，经微波改性后，活性炭孔壁变薄，以前闭塞、半闭塞的孔径也打开，孔隙更发达，表面粗糙不平，这些变化都有利于活性炭对色素的吸附，还能提高吸附速率，同时微波改性还使得活性炭表面碱性官能团增多，酸性官能团减少，有利于活性炭对糖液中各种非糖分的吸附，提高鱿鱼墨多糖的纯度。与现有技术相本文档来自技高网...

【技术保护点】
鱿鱼墨多糖的提取方法，包括鱿鱼墨粗多糖提取液制备、初步纯化、固相萃取柱层析、离子交换柱层析，其特征在于：所述初步纯化步骤为：将鱿鱼墨粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶和脂肪酶酶解，灭酶，离心，将上清液中加入正丁醇、氯仿和三乙醇胺的混合溶液，剧烈搅拌后离心，浓缩，再加入无水乙醇醇沉，静置过夜，进行沉淀多糖，离心，取沉淀抽滤，无水乙醇、丙酮洗沉淀，即得鱿鱼墨粗多糖。

【技术特征摘要】
1.鱿鱼墨多糖的提取方法，包括鱿鱼墨粗多糖提取液制备、初步纯化、固相萃取柱层析、离子交换柱层析，其特征在于：所述初步纯化步骤为：将鱿鱼墨粗多糖提取液中加入木瓜蛋白酶和脂肪酶酶解，灭酶，离心，将上清液中加入正丁醇、氯仿和三乙醇胺的混合溶液，剧烈搅拌后离心，浓缩，再加入无水乙醇醇沉，静置过夜，进行沉淀多糖，离心，取沉淀抽滤，无水乙醇、丙酮洗沉淀，即得鱿鱼墨粗多糖。2.根据权利要求1所述的鱿鱼墨多糖的提取方法，其特征在于：所述初步纯化步骤中酶解的pH为6.5-7.5、温度为55-65℃、时间为8-15min，灭酶温度为90-100℃、时间为10-20min。3.根据权利要求1所述的鱿鱼墨多糖的提取方法，其特征在于：所述初步纯化步骤中正丁醇、氯仿和三乙醇胺的混合溶液的添加量为上清液体积的0.2-0.3倍。4.根据权利要求1所述的鱿鱼墨多糖的提取方法，其特征在于：所述初步纯化步骤中正丁醇、氯仿和三乙醇胺的混合溶液中正丁醇、氯仿和三乙醇胺的体积比为1:0.2-0.3:0.02-0.03。5.根据权利要求1所述的鱿鱼墨多糖的提取方法，其特征在于：所述鱿鱼墨粗多糖提取液制备步骤为：从鱿鱼体内取出墨囊挤出鱿鱼墨，按料液比为1:1.5-2.5向鱿鱼墨中加入蒸馏水，在35-45℃下热水浸提3-5h，然后在0-5℃下继续浸提10-15h，离心，获得的上清液过超滤膜，即得鱿鱼墨粗多糖提取液。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨艳，
申请(专利权)人：舟山富晟食品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33