肉苁蓉多糖作为疫苗佐剂的应用制造技术

本发明专利技术提供一种肉苁蓉多糖作为疫苗佐剂的应用，通过动物分组及免疫方法、ELISA检测小鼠血清中抗OVA特异性抗体滴度及细胞免疫学活性等实验，结果证明肉苁蓉多糖可以作为蛋白疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗、灭活疫苗或减毒活疫苗佐剂，其免疫增强效果明显优于铝佐剂，其具有副作用小、来源广泛、易于生产，并且本发明专利技术的肉苁蓉多糖的制备过程简单，成本较低，并且收率较高，有利于大规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种免疫佐剂，尤其涉及肉苁蓉多糖在疫苗佐剂中的应用，属于生物

技术介绍
肉苁蓉（Herba Cistanche )为列当科植物，是寄生草本植物，生长在沙漠环境 中，主产于我国新疆、甘肃、内蒙古、宁夏等及中亚、西亚一带的荒漠中，有沙漠"人参"的美 誉，临床和民间应用广泛，《中国药典》收载荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉为药用肉苁蓉。新疆 是肉苁蓉的主产区，主产荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉。近十余年研究者们对其化学成分和药 理作用等方面进行了深入细致的研究，发现肉苁蓉具有免疫调节、神经保护、抗氧化、抗凋 亡、抗炎症、抗疲劳、抗衰老等多种药理作用，这些药理作用与肉苁蓉所含的多种有效成分， 如多糖、苯乙醇甙、黄酮等密切相关。 疫苗佐剂能够显著增强疫苗的免疫原性和安全性、节约抗原的用量，对于控制人 类及动物重大疫病的流行起到了非常重要的作用。佐剂一般可在多种疫苗中进行使用。尽 管许多原料可以应用于疫苗佐剂，但是大多只能诱发抗体反应或者产生一些副作用，因此 限制了它的实际应用。目前，能够用于临床的免疫佐剂种类很少，唯一通过FDA批准的能用 于人的佐剂一一铝胶佐剂只能激发体液免疫，不能诱导细胞介导的免疫反应，并且对人免 疫缺陷病毒（HIV)、丙型肝炎病毒（HCV)、流感病毒等抗原无效，所以筛选能够用于人体和 动物用的安全、高效、无毒副作用的新型疫苗佐剂的研究日益受到重视。 理想的新型免疫佐剂应该是对动物机体的细胞或体液免疫均有有效的激发作用、 作用持久稳定、免疫次数减少、副作用小，同时便于生产和易于注射。 大量的研究表明，植物来源的多糖对免疫系统发挥多方面的重要调节作用，又无 严重毒副反应而成为安全、高效新型疫苗佐剂的候选资源。植物来源的免疫活性物质，具有 资源丰富、价格低廉、毒副作用小、无残留等优点，因此植物多糖作为佐剂与疫苗配合使用 是佐剂研究发展的重要途径和新的趋势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供肉灰蓉多糖（Aqueous extracts of Cistanche deserticola，AEO))在疫苗佐剂中的应用。 本研究发现，肉苁蓉多糖能够明显刺激血清中抗体IgG、IgGjP IgG2a的产生，对 ConA和LPS刺激的淋巴细胞增殖反应明显增高，可以激发淋巴细胞分泌产生细胞因子IL-4 和IFN-y。表明肉苁蓉多糖不仅诱发了较强的体液免疫反应，而且诱导了较强的细胞免疫 反应，可以用于疫苗佐剂。 为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：本专利技术涉及所述的肉苁蓉多糖在 疫苗佐剂中的应用。 本专利技术所述的疫苗为蛋白疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、灭活疫苗或减毒活疫苗。 本专利技术所述的肉苁蓉多糖采用超声辅助水提醇沉法提取。本专利技术通过对新鲜或干 燥的新疆肉苁蓉粉末，石油醚脱脂，加入蒸馏水超声，滤液浓缩后加入无水乙醇搅拌沉淀， 沉淀物经过离心，真空干燥，得到肉苁蓉多糖的粗制品； 再对肉灰蓉粗多糖用Sevage试剂（氯仿：正丁醇=4 :1)除蛋白，离心，合并上清，重复 上述操作多次，收集上清，加入乙醇，静置过夜，沉淀物经过离心，真空干燥，得到肉苁蓉多 糖可作为疫苗佐剂。 本专利技术使用方法：肉苁蓉粗多糖与抗原采用皮下途径一起注射机体。所述的疫苗 为注射制剂，肉灰蓉多糖在所述注射制剂中的剂量为1.5mg/kg~50mg/kg。 本专利技术肉苁蓉粗多糖在疫苗佐剂中的应用，通过动物分组及免疫方法、ELISA检测 小鼠血清中抗OVA特异性抗体滴度及细胞免疫学活性等实验，结果证明肉苁蓉多糖可以作 为蛋白疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、灭活疫苗或减毒活疫苗的佐剂，其免疫增强效果明显优 于铝佐剂，其具有副作用小、来源广泛、易于生产，并且本专利技术的肉苁蓉多糖的制备过程简 单，成本较低，并且收率较高，有利于大规模生产。【附图说明】 图1为小鼠免疫OVA特异性抗体IgG滴度检测结果。 图2为小鼠免疫OVA特异性抗体IgGjPIgG2a的检测结果。 图3为ConA和LPS刺激后小鼠淋巴细胞增殖反应的情况。 图4为肉苁蓉多糖佐剂对小鼠淋巴细胞增殖的细胞因子IL-4产生的影响。 图5为肉苁蓉多糖佐剂对小鼠淋巴细胞增殖的细胞因子IFN-Y产生的影响。 图6为肉苁蓉多糖佐剂对流感疫苗IgG抗体水平产生的影响。 图7为肉苁蓉多糖佐剂对流感疫苗IgGjPIgG&抗体水平产生的影响。 图8为肉苁蓉多糖佐剂对口蹄疫疫苗IgG抗体水平产生的影响。 图9为肉苁蓉多糖佐剂对口蹄疫疫苗IgGjPIgG&抗体水平产生的影响。 图10为肉苁蓉多糖佐剂对小鼠OVA基因疫苗IgG抗体水平产生的影响。【具体实施方式】 以下结合本专利技术具体实施例，对本专利技术肉苁蓉多糖在疫苗佐剂的应用进行详细说 明。 实施例1 :不同剂量肉苁蓉多糖对小鼠免疫模式抗原卵清白蛋白（OVA)的动物实 验 本实施例肉苁蓉多糖的制备方法是： 步骤1 :新鲜或干燥的新疆肉苁蓉粉末，石油醚脱脂，加入蒸馏水超声，滤液浓缩后加 入无水乙醇搅拌沉淀，沉淀物经过离心，真空干燥，得到肉苁蓉多糖的粗制品； 步骤2 :肉灰蓉粗多糖用Sevage试剂（氯仿：正丁醇为4 :1)除蛋白，离心，合并上清， 重复上述操作多次，收集上清，加入乙醇，静置过夜，沉淀物经过离心，真空干燥，得到肉苁 蓉多糖。 实施方法： 试验材料：肉苁蓉多糖母液配置：〇.Ig的肉苁蓉多糖溶解在IOml生理盐水中，配置成 lOmg/ml的母液。配置OVA母液：0.0 lg OVA溶解在IOml的生理盐水中，配置成lmg/ml的 母液。 动物免疫：将6-8周龄ICR小鼠，随机分配成7组，每组6只，实验分组如表1所 示，每组疫苗溶解在生理盐水中，每只小鼠注射100微升，第0天皮下注射，第一次注射 后间隔14天进行再次注射，共注射两次。 为了检测小鼠体液免疫水平，皮下注射后采血，分离小鼠血清，间接ELISA法分别 检测IgGUgG 1和IgG2Jt体水平。以2 μg/ml OVA抗原包被96孔酶标板中，4°C过夜，3% 牛血清白蛋白37°C封闭2h ;PBST (将Tween 20溶于PBS，使Tween 20的终浓度为0.05% 得到的溶液）洗涤4次；加入按不同倍数稀释的小鼠血清，37°C孵育Ih ;PBST洗涤4次， 每次5分钟；加羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgGUgG1和IgG2a抗体（Southernbiotech) (均按1:5000稀释），37°C孵育lh。每孔加入底物TMB，37°C避光显色5-15min，加入终止 液2mol/L H2SO4，每孔50 y 1，终止显色，置于450nm/655nm测定每孔光密度值，阳性滴度的 终点为OD值高于等稀释度阴性血清(生理盐水组）平均值的2. 1倍。 结果如表2和图1所示(表2中的数值为6只小鼠混合血清的滴度）：生理盐水对 照组、无抗原的纯多糖组，IgG抗体水平较低，表明以上组合不具备免疫效果。无佐剂的OVA 抗原组产生了低水平的IgG，这表明OVA抗原有一定的免疫效果。相比以上组合，铝佐剂组， 含佐剂的低剂量组、中剂量组、高剂量组均能产生高水平的IgG，并且AE⑶100 y g组的效果 最为显著，与抗原对照组相比，抗体滴度增强了 30倍，略高于铝佐剂组，而且抗体的持续时 间较长本文档来自技高网...

【技术保护点】
肉苁蓉多糖作为疫苗佐剂的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱莲，吴道澄，杨秀梅，赵兵，巴雪丽，
申请(专利权)人：新疆大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65