本发明专利技术公开了一种蛋白制剂及在CIK细胞培养方面的应用，该蛋白制剂为树突状细胞的总蛋白，在提取树突状细胞的总蛋白之前，对树突状细胞进行高浓度CO2刺激，高浓度指CO2占空气体积分数＞5％。本发明专利技术提供的蛋白制剂可用于诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞，可用于替代组合复杂、成本较高的外源性细胞因子，提高培养便捷性，降低成本。
A protein preparation and its application in CIK cell culture
The invention discloses a protein preparation and its application in CIK cell culture, the protein preparations for total protein in dendritic cells, before extracting the total protein of dendritic cells, stimulation of high concentration of CO2 on dendritic cells, high concentrations of CO2 for air volume fraction > 5%. The protein preparation provided by the invention can be used for inducing the preparation of CIK cells with high antitumor activity, and can be used for replacing the complex and high cost exogenous cytokines so as to improve the culture convenience and reduce the cost.
【技术实现步骤摘要】
一种蛋白制剂及在CIK细胞培养方面的应用
本专利技术属于细胞免疫领域，涉及CIK细胞，具体涉及一种蛋白制剂及在CIK细胞培养方面的应用。
技术介绍
肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercell，CIK)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤生物免疫治疗的主力军。CIK细胞的主要效应细胞为CD3+CD56+表型T淋巴细胞，兼有NK细胞和T细胞的特征。在功能上，CIK一方面拥有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，另一方面还拥有NK细胞非MHC限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。CIK细胞的增殖和细胞毒活性依赖于培养条件的刺激。培养高纯度CD3+CD56+细胞是提高CIK细胞毒活性、增强对肿瘤细胞杀伤的关键。现有技术通常都是通过在培养基中添加多种外源性细胞因子进行诱导刺激。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蛋白制剂，以替代组合复杂、成本较高的外源性细胞因子，以诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞。本专利技术通过如下技术方案得以实现：一种蛋白制剂，为树突状细胞的总蛋白，在提取所述树突状细胞的总蛋白之前，对树突状细胞进行高浓度CO2刺激；所述高浓度指CO2占空气体积分数＞5％。优选地，高浓度指CO2占空气体积分数25-45％。优选地，高浓度CO2刺激时间为2-4小时。上述蛋白制剂在培养扩增CIK细胞方面的应用。本专利技术优点：本专利技术提供的蛋白制剂可以用于诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞，可以用于替代组合复杂、成本较高的外源性细胞因子，提高培养便捷性，降低成本。附图说明图1为各组CIK细胞对SMMC-7721细胞的杀伤率(A为效靶比10:1，B为效靶比20:1)。具体实施方式为了更好地解释本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。RPMI-1640培养基和胎牛血清均为Gibco产品。实施例1：总蛋白的制备1、单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃、5％CO2孵箱中孵育2h。2、树突状细胞(DC细胞)的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在完全培养基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)诱导DC生成，于37℃、5％CO2孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加TNF-α诱导DC成熟(100ng/mL)，连续培养7d。3、总蛋白提取：提取前3小时，将成熟DC置于37℃、35％CO2孵育箱中培养3小时。3小时后，按照如下方法提取总蛋白，分装后-70℃保存，避免反复冻融：(1)吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，收集至离心管，1000rpm离心5分钟，洗涤后的细胞转移至洁净EP管；(2)冰上操作，配制细胞裂解液，1mlLysisBuffer中加入10μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂、5μl100mM的PMSF，混匀后冰上保存数分钟待用；(3)在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液，移液器反复吹打使细胞充分裂解；(4)4℃摇床温和振摇15分钟，然后用4℃离心机14000rpm离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物；(5)BCA法测蛋白浓度。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。实施例2：总蛋白的制备1、单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃、5％CO2孵箱中孵育2h。2、树突状细胞(DC细胞)的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在完全培养基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)诱导DC生成，于37℃、5％CO2孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加TNF-α诱导DC成熟(100ng/mL)，连续培养7d。3、总蛋白提取：提取前2小时，将成熟DC置于37℃、45％CO2孵育箱中培养2小时。2小时后，按照如下方法提取总蛋白，分装后-70℃保存，避免反复冻融：(1)吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，收集至离心管，1000rpm离心5分钟，洗涤后的细胞转移至洁净EP管；(2)冰上操作，配制细胞裂解液，1mlLysisBuffer中加入10μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂、5μl100mM的PMSF，混匀后冰上保存数分钟待用；(3)在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液，移液器反复吹打使细胞充分裂解；(4)4℃摇床温和振摇15分钟，然后用4℃离心机14000rpm离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物；(5)BCA法测蛋白浓度。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。实施例3：总蛋白的制备1、单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃、5％CO2孵箱中孵育2h。2、树突状细胞(DC细胞)的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在完全培养基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)诱导DC生成，于37℃、5％CO2孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加TNF-α诱导DC成熟(100ng/mL)，连续培养7d。3、总蛋白提取：提取前4小时，将成熟DC置于37℃、25％CO2孵育箱中培养4小时。4小时后，按照如下方法提取总蛋白，分装后-70℃保存，避免反复冻融：(1)吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，收集至离心管，1000rpm离心5分钟，洗涤后的细胞转移至洁净EP管；(2)冰上操作，配制细胞裂解液，1mlLysisBuffer中加入10μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂、5μl100mM的PMSF，混匀后冰上保存数分钟待用；(3)在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液，移液器反复吹打使细胞充分裂解；(4)4℃摇床温和振摇15分钟，然后用4℃离心机14000rpm离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物；(5)BCA法测蛋白浓度。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。实施例4：总蛋白的制备，与实施例1对比与实施例1相比，除总蛋白提取之前不进行35％CO2孵育刺激外，其他完全相同。实施例5：效果实施例，对CIK细胞杀瘤活性的影响一、实验方法1、CIK细胞的原代培养和分组单个核细胞的分离：采集本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白制剂，为树突状细胞的总蛋白，其特征在于：在提取所述树突状细胞的总蛋白之前，对树突状细胞进行高浓度CO2刺激；所述高浓度指CO2占空气体积分数＞5％。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白制剂，为树突状细胞的总蛋白，其特征在于：在提取所述树突状细胞的总蛋白之前，对树突状细胞进行高浓度CO2刺激；所述高浓度指CO2占空气体积分数＞5％。2.根据权利要求1所述的蛋白制剂，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡攀勇，黄欣，张钟祥，
申请(专利权)人：南京佰泰克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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