抗体纯化方法技术

在此公开的内容包括：一种纯化生物组合物的方法，包括渗滤生物组合物成为含磷酸盐缓冲液(PBS)的组合物，从而获得纯化组合物。该方法特别适用于从生物组合物中去除一种或多种杂质，例如二(2‑羟乙基)氨基‑三(羟甲基)甲烷(Bis‑tris)。

Antibody purification method

Disclosed herein is a method of purifying a biological composition comprising a percolating biological composition as a phosphate buffer (PBS) composition, thereby obtaining a purification composition. This method is especially suitable for the removal of one or more impurities from the biological composition, such as two (2 hydroxyethyl) amino three (Qiang Jiaji) methane (Bis tris).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗体纯化方法相关申请的交叉援引本申请要求2014年7月25日提交的美国临时申请62/028,994的优先权，本文援引并采纳该临时申请的全部内容。
技术介绍
通常要求纯化单克隆抗体和其它生物材料的已知方法能够去除不希望其存在的杂质，这对于用于医疗目的生物制品而言尤其重要。去除杂质的方法之一是渗滤。渗滤是一种已知方法，相关记载可见于例如：WayneP.Olson，《分离技术：药学与生物技术应用》(SeparationsTechnology:PharmaceuticalandBiotechnologyApplications)(英特法姆出版社(InterpharmPress)，1995；MunirCheryan，《超滤与微滤手册》(UltrafiltrationandMicrofiltrationHandbook)，第二版，CRC出版社(CRCPress)，1998；StefanBehme，《药用蛋白质的制造》(ManufacturingofPharmaceuticalProteins)(Wiley-VCH出版社2009)；以及GlynN.Stacey，《来自动物细胞培养的药品》(MedicinesfromAnimalCellCulture)(约翰威立出版社(JohnWiley)2007)；本文援引并采纳以上文献的全部内容。Ch14.18(本文中亦称“dinutuximab”)是一种抗-GD2单克隆抗体，参见Gillies等，JournalofImmunologicalMethods，125:191-202(1989)，本文援引并采纳其全部内容。当ch14.18抗体用于治疗，去除杂质(例如二(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-tris))非常重要，为的是确保该单克隆抗体的安全性和有效性。因此，需要更多去除生物组合物中不希望其存在的杂质的方法。专利技术概述本文中许多实施方式涉及纯化生物组合物的方法，所述方法包括用磷酸盐缓冲液(PBS)对生物组合物进行渗滤，从而获得纯化组合物。实施方式之一中，生物组合物包含至少一种分离的蛋白质。实施方式之一中，分离的蛋白质是单克隆抗体。实施方式之一中，单克隆抗体是ch14.18。实施方式之一中，生物组合物还含有至少一种杂质。实施方式之一中，杂质是二(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-tris)。实施方式之一中，生物组合物中Bis-tris的浓度是pH6.3至6.7下10至50mMBis-tris。实施方式之一中，渗滤去除生物组合物中至少50％的Bis-tris。实施方式之一中，渗滤去除生物组合物中至少70％的Bis-tris。实施方式之一中，PBS的浓度是10至50mM磷酸钠和100至200mMNaCl。实施方式之一中，在被渗滤成为含PBS的组合物之前，单克隆抗体被浓集至至少2.0至5.0AU的浓度。实施方式之一中，在被渗滤成为含PBS的组合物之前，单克隆抗体被浓集至至少4.0至6.0AU的浓度。实施方式之一中，本文中的方法还包括用至少一种层析柱分离和纯化单克隆抗体。实施方式之一中，本文中的方法包括用至少一种亲和层析柱、至少一种阳离子交换层析柱和/或至少一种阴离子交换层析柱分离和纯化单克隆抗体。实施方式之一中，阴离子交换层析柱是CaptoTM附着柱。实施方式之一中，用含Bis-tris的组合物将单克隆抗体从CaptoTM附着柱上洗脱。实施方式之一中，至少三体积单位生物组合物被渗滤成为一体积单位的含PBS的组合物。实施方式之一中，至少五体积单位生物组合物被渗滤成为一体积单位的含PBS的组合物。实施方式之一中，纯化的组合物经进一步渗滤成为含组氨酸的组合物。本文所述还包括一种纯化单克隆抗体的方法，包括：(a)使含单克隆抗体的第一组合物过亲和层析柱，得到含所述单克隆抗体的第二组合物；(b)调低第二组合物的pH，得到第三组合物；(c)用溶剂-除垢剂清洗第三组合物，得第四组合物；(d)清洗第四组合物以去除溶剂-除垢剂，得第五组合物；(e)使第五组合物过阳离子交换层析柱，得到含所述单克隆抗体的第六组合物；(f)对第六组合物进行纳滤，得第七组合物；(g)使第七组合物过阴离子交换层析柱，得到含所述单克隆抗体和Bis-tris的第八组合物：(h)渗滤第八组合物成为含PBS的组合物，得含有所述单克隆抗体且基本不含Bis-tris的第九组合物。附图说明图1：ch14.18经PBS渗滤后的弱阳离子交换HPLC分析。谱线A代表经PBS渗滤的ch14.18。谱线B代表渗滤入HBS的ch14.18，均为215nm监测。图2：25mMBis-tris样品加载到弱阳离子交换HPLC柱，滞留时间约7分钟处的峰来自Bis-tris。对25mMBis-tris的弱阳离子交换分析。谱线A显示215nm处监测的吸光度。谱线B显示280nm处监测的吸光度。图3：CaptoTM附着柱采用新树脂或曾用树脂所得的汇合洗脱物的弱阳离子HPLC，滞留时间约7分钟处的峰来自Bis-tris，而不是来自柱上因此前用过而残留的污染物。CaptoTM附着柱汇合洗脱物样品均无源自新层析柱或曾用层析柱的ch14.18。谱线A是来自新柱的样品。谱线B是来自曾用柱的样品。图4：渗滤入PBS前掺入了污染物的ch14.18的弱阳离子交换HPLC层析结果。谱线A代表没有掺混污染物的ch14.18。谱线B代表掺混了磷酸三丁酯和聚山梨醇酯80的ch14.18。谱线C代表掺混了氨甲蝶呤的ch14.18。约7分钟处的峰非纯化过程中任何痕量添加剂所致(图1和2)。图5：单克隆抗体(如ch14.18)纯化实施方式之一的流程图。该纯化过程最初是国家癌症研究所(NCI)研发的(见实施例2)，后经联合治疗公司(UnitedTherapeuticsCorp)改进(见实施例1)。优选实施方式说明本文中许多实施方式涉及纯化生物组合物的方法，包括用磷酸盐缓冲液(PBS)对生物组合物进行渗滤，从而获得纯化的组合物。生物组合物本文所述的方法能够纯化许多本领域所知的生物组合物。生物组合物可包含生物过程产生而非化学合成的至少一种物质，例如蛋白质、核酸、细胞、组织、疫苗，以及血液或其组分。例如，生物组合物可包含至少一种分离的蛋白质，包括重组蛋白质。例如，生物组合物可包含至少一种分离的核酸。例如，生物组合物可包含至少一种单克隆抗体。例如，生物组合物可包含至少一种嵌合、改造或人源化的抗体。特定实施方式之一中，生物组合物含有至少ch14.18单克隆抗体，但其他抗体和生物材料也可用本文所述的方法纯化。例如，生物组合物可含有至少一种杂质。杂质可以是例如不希望其存在的盐，如Bis-tris。生物组合物中Bis-tris杂质的浓度可能是例如1至100mMBis-tris，或10至50mMBis-tris，或20至40mMBis-tris。pH可以是例如6至7、或6.3至6.7或6.4至6.6。PBS渗滤某些实施方式中，本文所述方法包括将至少两、至少三、至少四、至少五或至少六体积单位的生物组合物渗滤入一体积单位PBS。某些实施方式中，生物组合物含有不希望其存在的Bis-tris，本文所述方法包括：通过PBS渗滤从所述生物组合物去除至少30％、至少50％、至少70％、至少90％或至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化生物组合物的方法，包括用磷酸盐缓冲液(PBS)对生物组合物进行渗滤，从而获得纯化组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.25 US 62/028,9941.一种纯化生物组合物的方法，包括用磷酸盐缓冲液(PBS)对生物组合物进行渗滤，从而获得纯化组合物。2.如权利要求1所述的方法，所述生物组合物包含至少一种分离的蛋白质。3.如权利要求2所述的方法，所述分离的蛋白质是单克隆抗体。4.如权利要求3所述的方法，所述单克隆抗体是ch14.18。5.如权利要求1所述的方法，所述生物组合物还含有至少一种杂质。6.如权利要求5所述的方法，所述杂质是二(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-tris)。7.如权利要求6所述的方法，所述生物组合物中Bis-tris的浓度为pH6.3至6.7下10至50mMBis-tris。8.如权利要求6所述的方法，所述渗滤从所述生物组合物去除至少50％的Bis-tris。9.如权利要求6所述的方法，所述渗滤从所述生物组合物去除至少70％的Bis-tris。10.如权利要求1所述的方法，PBS的浓度是10至50mM磷酸钠和100至200mMNaCl。11.如权利要求3所述的方法，在被渗滤成为含PBS的组合物之前，所述单克隆抗体被浓集至至少2.0至5.0AU的浓度。12.如权利要求3所述的方法，在被渗滤成为含PBS的组合物之前，所述单克隆抗体被浓集至至少4.0至6.0AU的浓度。13.如权利要求3所述的方法，还包括用至少一种层析柱分离和纯化所述单克隆抗体。14.如权利要求13所述的方法，包括用至少一种亲和层析柱、至少一种阳离子交换层析柱和/或至少一种阴离子交换层析柱分离和纯化所述单克隆抗体。15.如权利要求14所述的方法，所述阴离子交换层析柱是CaptoTM附着柱。16.如权利要求15所述的方法，用含Bis-tris的组合物从CaptoTM附着柱上洗脱所述单克隆抗体。17.如权利要求1所述的方法，将至少三体积单位生物组合物渗滤成为一体积单位的含PBS的组合物。18.如权利要求1所述的方法，将至少五体积单位生物组合物渗滤成为一体积单位的含PBS的组合物。19.如权利要求1所述的方法，将纯化的组合物再度渗滤成为含组氨酸的组合物。20.一种纯化单克隆抗体的方法，包括：(a)使含所述单克隆抗体的第一组合物过亲和层析柱，得含所述单克隆抗体的第二组合物；(b)将第二组合物pH调低，得第三组合物；(c)用溶剂-除垢剂清洗第三组合物，得第四组合物；(d)清洗第四组合物以去除溶剂-除垢剂，得第五组合物；(e)使第五组合物过阳离子交换层析柱，得含所述单克隆抗体的第六组合物；(f)对第六组合物进行纳滤，得第七组合物；(g)使第七组合物过阴离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·梅，T·阿托拉格贝，G·M·法夸尔森，S·沙班，M·科勒克，G·米特拉，
申请(专利权)人：联合治疗学有限公司，以秘书处，卫生和人类服务部为代表的美利坚合众国，
类型：发明
国别省市：美国,US