疏水性肽的制造方法技术

本发明专利技术的目的在于提供一种通用性优异的制造方法，该方法在用亲水性单元对固相合成后的疏水性肽进行亲水化而进行HPLC纯化时，能够以所有疏水性肽作为纯化对象而不依赖于N末端的氨基酸残基的种类，而且能够根据该疏水性肽的种类而随机应变地选择亲水性单元。本发明专利技术是从由以C末端侧键合于该载体的第1肽链构成的带有载体的粗制肽获得纯化肽的方法，该方法包括：亲水化工序A，向带有载体的粗制肽的氨基依次分步导入或一步导入接头和亲水性单元，获得无载体的亲水化肽体；载体切除工序B，用于在从将接头键合于带有载体的粗制肽之前至得到亲水化肽体的任意阶段中、或者在得到了带有载体的亲水化肽体之后，切断第1肽链与载体之间的键；色谱纯化工序，将由亲水化工序A及载体切除工序B得到的无载体的亲水化肽体溶解于水并用液相色谱进行处理；以及接头切除工序，通过化学处理将色谱纯化后的无载体的亲水化肽体中含有的接头‑第1肽链之间的键切断。

Process for the production of hydrophobic peptides

The aim of the invention is to provide a manufacturing method of excellent general, the method used in the hydrophilic hydrophobic unit of solid phase peptide synthesis of hydrophilic and HPLC purification, amino acid residues in all types to hydrophobic peptides as the object of purification and does not depend on the N end, and according to the the types of hydrophobic peptides and to choose the hydrophilic unit. The present invention is from C to the end side of bonding formed in the carrier of the crude peptide first peptide with vector method to obtain purified peptides, the method comprises: a hydrophilic chemical sequence of A, to the crude peptide carrier with amino sequence step by step step into import or joint and hydrophilic units, obtain hydrophilic peptide no carrier; carrier removal process of B, used in the joint prior to bonding from crude peptide with carrier to get any stage in the hydrophilic peptide, or hydrophilic peptides in the body with carrier obtained after cutting between the first peptide and carrier bond; purification by chromatography, hydrophilic chemical ordering A and carrier carrier free B removal process of the hydrophilic peptide dissolved in water and treated by liquid chromatography; and the joint resection procedure, through chemical treatment will be purified with chromatography without hydrophilic carrier The joint first peptide containing peptide in the body of the key cut.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】疏水性肽的制造方法
本专利技术涉及简便地对键合了载体的粗制肽进行纯化而制造纯化肽的方法、以及适于该纯化肽的制造方法的接头。
技术介绍
作为化学合成肽和蛋白质的方法，作为代表性的方法已知有：用聚苯乙烯高分子凝胶珠等作为固相，对其反复进行氨基酸的缩合反应和末端保护基的脱保护，由此使肽链依次延长的固相合成法；以及，在液相中反复进行氨基酸的缩合反应和末端保护基的脱保护，由此使肽链延长的液相合成法。其中，固相合成法中高分子凝胶键合于生成的肽链而不溶，因此可通过过滤等除去原料试剂等可溶性杂质，容易进行粗纯化。然后，对于通过除去高分子凝胶而得到的肽而言，在其为亲水性的情况下，可以利用反相HPLC等进一步进行纯化。然而，在生成的肽为疏水性的情况下，无法用反相HPLC进行纯化，产生难以高纯度化的问题。作为固相合成的疏水性肽的纯化技术，已知如下方法：一方面从疏水性肽上切断除去固相载体，另一方面使亲水性肽键合，在暂时使疏水性肽亲水化而实施了HPLC纯化后，切断除去该亲水性肽，获得高纯度的疏水性肽。例如，专利文献1中记载了通过应用生物技术而使亲水性肽键合于疏水性肽的技术。但是，在利用生物技术的情况下，其制造效率受到目标疏水性肽的序列的很大影响，有时难以大量生产，存在缺乏技术通用性的问题。作为将亲水性氨基酸连续地键合于疏水性肽并进行亲水化、HPLC纯化的技术，除了上述使用了生物技术的肽制造方法以外，还已知：利用了Boc固相合成法的技术(非专利文献1)、利用了Fmoc固相合成法的技术(非专利文献2～5等)。在采用这些化学方法形成肽的情况下，由于连续地反复进行氨基酸的保护基的脱保护和肽合成，因此不需要在氨基酸脱保护反应条件下切断疏水性肽与固相载体之间的键。例如，在Boc固相合成法中，为了用作为强酸的TFA对氨基酸的保护基进行脱保护，而使疏水性肽与固相载体之间的键具有耐强酸性。该疏水性肽与固相载体的键的切断通常使用HF。但是，HF危险且有害，需要特殊的制造装置。在Fmoc固相合成法中，由于可以在碱性条件下进行脱保护，因此与固相载体的键合方法的自由度高。例如，在非专利文献2、3中公开了如下方法：用Fmoc固相合成法在固相载体上合成亲水性肽，接着在其N末端侧键合4-羟甲基苯甲酸作为接头，再用Fmoc固相合成法合成疏水性肽。在该方法中，固相载体与肽链容易切断，而且接头的羟基侧(疏水性肽键合侧)也容易切断。但是，在该方法中，难以根据目标肽(疏水性肽)的氨基酸序列而适当变更亲水性肽，缺乏方法的通用性。另外，在从接头的羟基侧除去亲水性肽时需要强碱性条件。因此，存在因以天冬酰亚胺(aspartimide)化为代表的副反应所导致的纯度降低的隐患，也存在得到的疏水性肽的C末端侧的形态仅限于羧酸的问题。非专利文献4和5的方法为相同的Fmoc固相合成法，而且在能够用固相合成法先合成疏水性肽(目标肽)方面比上述非专利文献2、3的方法更优异。该方法需要在合成N末端具有亲水性肽和亚苯基型化合物的氨基酸之后完成疏水性肽的序列。因此，由于每个疏水性肽需要N末端具有亲水性肽和亚苯基型化合物的氨基酸，可以认为是繁琐的工艺。另外，最终得到的疏水性肽无法使N末端侧为半胱氨酸、蛋氨酸，缺乏通用性。另外，在该方法中，难以根据目标肽(疏水性肽)的氨基酸序列而适当变更亲水性肽，在这一方面也缺乏方法的通用性。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开平07-102000号公报非专利文献非专利文献1：Englebretsen、D.R.等著、Tetrahedron1999、55、6623；非专利文献2：Hossain、M.A等著、Bioconjutgate.Chem.2009、20、1390；非专利文献3：Choma、C.T.等著、TetrahedronLetters1998、39、2417；非专利文献4：Vorherr、T.著、ChimicaOggi2007、25、22；非专利文献5：Dick、F等著、Eur.Pept.Symp.29th、Gdansk2006、PosteTh009。
技术实现思路
专利技术要解决的课题因此，本专利技术的目的在于提供一种制造方法，该方法在用亲水性单元对固相合成的疏水性肽进行亲水化并进行HPLC纯化时，能够不依赖于N末端的氨基酸残基的种类而以全部疏水性肽作为纯化对象，且疏水性肽的C末端侧的形态不受羧酸的限制，另外，可以根据疏水性肽的种类而随机应变地选择亲水性单元，而且通用性优异。解决课题的方法本专利技术人为了解决上述课题进行了深入研究，结果是，首先，以随后向固相合成的目标肽导入接头和亲水性单元的形式，将亲水性单元设计为能够随机应变地进行选择的形式。由此，可以使C末端侧的形态不限定于羧酸而进行亲水化。因此发现，在导入接头和亲水性单元时，只要预先将目标肽与接头的键设计为能够通过化学处理来切断的形式，就能够形成该键而不依赖于目标肽的N末端氨基酸的种类，可以扩展目标肽的种类，且这样的键具有对氨基酸保护基的脱保护条件(作为Fmoc脱保护条件的哌啶条件等)、对从固相载体上切下(TFA条件等)的耐性，能够制造用于HPLC纯化的无载体的亲水化肽体(目标肽、接头和亲水性单元的键合体)，而且在该纯化后可以简便地切断除去亲水性单元及接头，由此完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。[1]一种纯化肽的制造方法，其是从由载体和以C末端侧键合于该载体的第1肽链构成的带有载体的粗制肽获得纯化肽的方法，该方法包括：亲水化工序A，向带有载体的粗制肽的氨基依次分步导入或一步导入接头和亲水性单元，获得无载体的亲水化肽体；载体切除工序B，用于在从将接头键合于带有载体的粗制肽之前至得到亲水化肽体的任意阶段中、或者在得到了带有载体的亲水化肽体之后，切断第1肽链与载体之间的键；色谱纯化工序，用液相色谱对由亲水化工序A及载体切除工序B得到的无载体的亲水化肽体进行处理；以及接头切除工序，通过化学处理将色谱纯化后的无载体的亲水化肽体中含有的接头-第1肽链之间的键切断。[2]根据[1]所述的纯化肽的制造方法，其中，通过催化还原或酸来进行所述接头切除工序。[3]根据[2]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有酸和路易斯酸的混合溶液来进行所述接头切除工序。[4]根据[3]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有TFA和路易斯酸的混合溶液来进行所述接头切除工序。[5]根据[4]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有TFA、TMSOTf及茴香硫醚的混合溶液来进行所述接头切除工序。[6]根据[2]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用pKa-2以下的酸来进行所述接头切除工序。[7]根据[2]所述的纯化肽的制造方法，其中，使用金属担载催化剂来进行所述接头切除工序。[8]根据[1]～[7]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元为亲水性肽、聚醚或多胺。[9]根据[1]～[8]中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水化工序A由使接头键合于粗制肽的氨基的接头键合工序和将亲水性单元键合于得到的接头键合体的接头部位的亲水性单元键合工序构成，在所述亲水性单元键合工序中，通过Fmoc固相合成法分步地使多个氨基酸键合于接头部位、或使预先制备的亲水性肽链键合于接头部位、或使预先制备的聚醚键合于接头部位、或者使预先制备的多胺键合于接头部位。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化肽的制造方法，其是从由载体和以C末端侧键合于该载体的第1肽链构成的带有载体的粗制肽获得纯化肽的方法，该方法包括：亲水化工序A，向带有载体的粗制肽的氨基依次分步导入或一步导入接头和亲水性单元，获得无载体的亲水化肽体；载体切除工序B，用于在从将接头键合于带有载体的粗制肽之前至得到亲水化肽体的任意阶段中、或者在得到了带有载体的亲水化肽体之后，切断第1肽链与载体之间的键；色谱纯化工序，用液相色谱对由亲水化工序A及载体切除工序B得到的无载体的亲水化肽体进行处理；以及接头切除工序，通过化学处理将色谱纯化后的无载体的亲水化肽体中含有的接头‑第1肽链之间的键切断。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.26 US 62/055,9911.一种纯化肽的制造方法，其是从由载体和以C末端侧键合于该载体的第1肽链构成的带有载体的粗制肽获得纯化肽的方法，该方法包括：亲水化工序A，向带有载体的粗制肽的氨基依次分步导入或一步导入接头和亲水性单元，获得无载体的亲水化肽体；载体切除工序B，用于在从将接头键合于带有载体的粗制肽之前至得到亲水化肽体的任意阶段中、或者在得到了带有载体的亲水化肽体之后，切断第1肽链与载体之间的键；色谱纯化工序，用液相色谱对由亲水化工序A及载体切除工序B得到的无载体的亲水化肽体进行处理；以及接头切除工序，通过化学处理将色谱纯化后的无载体的亲水化肽体中含有的接头-第1肽链之间的键切断。2.根据权利要求1所述的纯化肽的制造方法，其中，通过催化还原或酸来进行所述接头切除工序。3.根据权利要求2所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有酸和路易斯酸的混合溶液来进行所述接头切除工序。4.根据权利要求3所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有TFA和路易斯酸的混合溶液来进行所述接头切除工序。5.根据权利要求4所述的纯化肽的制造方法，其中，使用含有TFA、TMSOTf及茴香硫醚的混合溶液来进行所述接头切除工序。6.根据权利要求2所述的纯化肽的制造方法，其中，使用pKa-2以下的酸来进行所述接头切除工序。7.根据权利要求2所述的纯化肽的制造方法，其中，使用金属担载催化剂来进行所述接头切除工序。8.根据权利要求1～7中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水性单元为亲水性肽、聚醚或多胺。9.根据权利要求1～8中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，所述亲水化工序A由使接头键合于粗制肽的氨基的接头键合工序和将亲水性单元键合于得到的接头键合体的接头部位的亲水性单元键合工序构成，在所述亲水性单元键合工序中，通过Fmoc固相合成法分步地使多个氨基酸键合于接头部位、或使预先制备的亲水性肽链键合于接头部位、或使预先制备的聚醚键合于接头部位、或者使预先制备的多胺键合于接头部位。10.根据权利要求1～9中任一项所述的纯化肽的制造方法，其中，在通过所述亲水化工序A得到了带有载体的亲水化肽体之后，实施载体切除工序B。11.根据权利要求1～10中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：高津庆士，前田博文，藤井章雄，李风英，王小兵，
申请(专利权)人：株式会社钟化，阿纳斯派克股份有限公司，
类型：发明
国别省市：日本,JP