通过加入还原剂控制蛋白溶液中二硫键的形成制造技术

本发明专利技术公开了经开发以控制通过生物过程所产生的多聚体蛋白的多肽之间二硫键形成的方法。还公开了允许控制二硫键形成的蛋白溶液参数。在一个实例中，本发明专利技术公开的方法能够用于控制半抗体分子在抗体溶液中的比例。

Control of the formation of two sulfur bonds in protein solutions by addition of reducing agents

A method is disclosed for forming two sulfur bonds between polypeptides obtained by a multimeric protein produced by biological processes. A protein solution parameter that permits the formation of a two sulfur bond is also disclosed. In one example, the method disclosed herein can be used to control the proportion of half antibody molecules in antibody solutions.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过加入还原剂控制蛋白溶液中二硫键的形成相关申请本申请要求2015年3月25日递交的美国专利申请No.14/668,820的优先权，其要求2014年5月28日递交的美国临时申请No.62/004,175的权益，其公开内通过提述明确并入本文。
本专利技术涉及重组蛋白和抗体的生物技术以及生物制造的方法。专利技术背景蛋白的多肽之间的二硫键形成是正确的蛋白装配和结构的一个关键方面。蛋白的多聚化可能依赖于多肽(例如多肽单体/多聚体)之间形成充分水平的二硫键。抗体代表一类蛋白，其特别依赖于二硫键形成。抗体通常由四个多肽构成，即两条轻链和两条重链(L:H:H:L)。大多数抗体在四条多肽链之间含有二硫键。重链多肽之间的二硫键有时不会形成，导致形成在两对重链和轻链之间不含链间二硫键的抗体。通常而言，参见图1。这些抗体已被称为半抗体(在本文中缩写为“Hab”)。一些抗体类别和类型更容易形成半抗体，如免疫球蛋白G，亚型4(本文缩写为“IgG4”)的抗体。在天然抗体和重组抗体二者的生产中，显著比例的IgG4(至少高达35％)被制成半抗体(Miesages等,2012,BiotechnolBioeng.109(8):2048-58)。在生理条件下，由于两个重链-轻链抗体半部之间的强力非共价相互作用，半抗体通常作为完整的、功能性抗体存在，尽管缺乏链间二硫键。(Rose等,2011,Structure,19(9):1274-82)。半抗体形成与异常蛋白的形成相关(参见图1)。例如，IgG4抗体中的半抗体形成可能是由于铰链区的一级氨基酸序列和结构，其导致IgG4抗体能够进行动态的Fab臂交换，其中两个抗体能够彼此重组以形成双特异性抗体。(参见例如，美国专利No.4,470,925；美国专利申请公开No.US2011/0086366A1)。IgG4亚型的这种特征可能是由铰链区柔性的增加引起的，这使其更容易形成环状链内二硫键。(Bloom等,1997,ProteinSci.6(2):407-15；Schuurman等,2001,MolImmunol.38(1):1-8)。半抗体的形成可以追溯到重链恒定域中的缺失，如在某些骨髓瘤中产生的抗体中(Spiegelberg等,1975,Biochemistry14(10):2157-63)。目前尚不知晓半抗体与任何独特的临床症状或毒理学相关。然而，半抗体的水平是产生和/或制造治疗性IgG4抗体的关键质量属性。对于能够用来控制最终药物物质中多聚体蛋白的多肽之间二硫键形成的上游或下游抗体加工条件所达到的程度的了解是贫乏的。专利技术概述本文所公开的专利技术涵盖了经开发用于控制通过生物过程产生的蛋白的多肽之间二硫键形成的方法。一方面，本专利技术包括用于控制通过生物过程产生的多聚体蛋白的多肽之间二硫键数目的方法。这一方面的一些实施方案包括以下步骤：(a)将多肽在生物过程中特定的时间点与调理的溶液(conditionedsolution)接触，其中所述调理的溶液包含一个或多个预定的溶液参数，和(b)将包含该多肽的调理的溶液在预定的温度温育预定的时间，其中所述多肽与调理的溶液的温育控制蛋白的多肽间的二硫键形成。在一些实施方案中，当应用本文公开的方法时，蛋白多肽之间的二硫键数目增加。在其它实施方案中，蛋白多肽之间的二硫键数目减少。而在实施方案中，蛋白多肽之间的二硫键数目得以维持。在本专利技术的方法的一些实施方案中，预定的溶液参数包括如下一种或多种：氧化还原试剂本体(redoxreagentidentity)、氧化还原试剂浓度、pH、气体本体(gasidentity)、溶解的气体水平、电导率和活细胞密度。在本专利技术的方法的一些实施方案中，氧化还原试剂本体是2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺(dithiobutylamine)或亚硫酸钠。在这些实施方案的一些中，氧化还原试剂本体是2-MEA。在这些实施方案的一些中，氧化还原试剂的摩尔浓度(molarity)与蛋白的摩尔浓度比是至少约4:1、8:1、16:1或32:1。在本专利技术的方法的一些实施方案中，温育的预定温度是约2℃至约23℃。在其它实施方案中，温育的预定温度是约23℃至约37℃或更高。在本专利技术的方法的一些实施方案中，在温育期间混合包含多聚体蛋白的多肽的调理的溶液。在一些实施方案中，本专利技术的方法的生物过程包括分批、半连续或连续生物过程。在一些实施方案中，将多聚体蛋白的多肽在生物过程中的特定时间点与调理的溶液接触，该时间点发生在生物过程中的生物反应器操作和/或补料分批细胞培养操作之后。在一些实施方案中，本专利技术的方法进一步包括在生物过程中的特定时间点将多肽从该生物过程中移出的步骤。在这些实施方案的一些中，本专利技术的方法进一步包括在温育之后将所述多肽返回至该生物过程的步骤。本专利技术的方法的另一方面，将多聚体蛋白的多肽与调理的溶液在生物过程中的特定时间点接触，所述特定时间点是当多肽处于包含多个细胞的溶液中时。在这些实施方案的一些中，所述特定时间点是当多肽位于包含多个细胞的生物反应器、容纳槽或非生物反应器单元操作容器中的时间点。在本专利技术的方法的另一方面，将多聚体蛋白的多肽与调理的溶液在特定时间点接触，所述时间点是当该多聚体蛋白处于无细胞溶液中时。在这些实施方案的一些中，所述特定时间点发生在病毒灭活、调整、色谱、过滤、稀释、浓缩步骤或任何无细胞的生物过程步骤过程中。在其它实施方案中，所述特定时间点发生在生物过程的澄清阶段、澄清的收获物阶段、捕获阶段、中间色谱阶段(intermediatechromatographystage)或精修色谱阶段(polishingchromatographystage)过程中。在这些实施方案的一些中，该生物过程中的特定时间点包括其中所述多肽位于容纳槽中的时间点。在一些其它实施方案中，包含所述多肽的调理的溶液在温育步骤之后的pH是约3.0至约5.0。在一个实施方案中，含有多聚体蛋白的多肽的无细胞溶液包含蛋白A洗脱液。在另一实施方案中，含有多聚体蛋白的多肽的无细胞溶液包含澄清的收获物。在本专利技术的方法的一些实施方案中，多聚体蛋白的多肽是蛋白的单体。在其它实施方案中，多聚体蛋白的多肽是蛋白的多聚体。在另一方面，根据本专利技术的方法进行控制的多聚体蛋白是抗体。在这些实施方案的一些中，所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽。在其它实施方案中，所述多聚体蛋白的多肽包含轻链多肽。而在其它实施方案中，所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽和轻链多肽。在一个实施方案中，本专利技术的方法的抗体是IgG4抗体。在另一实施方案中，本专利技术的方法的抗体包括那他珠单抗(natalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)或夫苏木单抗(fresolimumab)。在另一方面，根据本专利技术的方法进行控制的多聚体蛋白是抗体片段。在这些实施方案的一些中，所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽。在其它实施方案中，所述多聚体蛋白的多肽包含轻链多肽。而在其它实施方案中，所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽和轻链多肽。在一个实施方案中，本专利技术的方法的抗体片段是IgG4抗体片段。在另一方面，根据本专利技术的方法进行控制的多聚体蛋白是非抗体蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种控制通过生物过程产生的多聚体蛋白的多肽之间二硫键数目的方法，该方法包括：在所述生物过程中特定的时间点将所述多肽与调理的溶液接触，其中所述调理的溶液包含一个或多个预定的溶液参数，及将包含所述多肽的调理的溶液在预定的温度温育预定的时间；其中所述多肽与调理的溶液的温育控制蛋白的多肽之间二硫键的形成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.28 US 62/004,175;2015.03.25 US 14/668,8201.一种控制通过生物过程产生的多聚体蛋白的多肽之间二硫键数目的方法，该方法包括：在所述生物过程中特定的时间点将所述多肽与调理的溶液接触，其中所述调理的溶液包含一个或多个预定的溶液参数，及将包含所述多肽的调理的溶液在预定的温度温育预定的时间；其中所述多肽与调理的溶液的温育控制蛋白的多肽之间二硫键的形成。2.权利要求1的方法，其中所述蛋白的多肽之间的二硫键数目增加。3.权利要求1的方法，其中所述蛋白的多肽之间的二硫键数目减少。4.权利要求1的方法，其中所述蛋白的多肽之间的二硫键数目得以维持。5.权利要求1的方法，其中所述预定的溶液参数包括如下一个或多个：氧化还原试剂本体、氧化还原试剂浓度、pH、气体本体、溶解的气体水平、电导率和活细胞密度。6.权利要求5的方法，其中所述氧化还原试剂本体是2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺(dithiobutylamine)或亚硫酸钠。7.权利要求6的方法，其中所述氧化还原试剂本体是2-巯基乙胺(2-MEA)。8.权利要求6的方法，其中所述氧化还原试剂的摩尔浓度与蛋白的摩尔浓度比是至少约4:1、8:1、16:1或32:1。9.权利要求1的方法，其中所述温育的预定温度是约2℃至约23℃。10.权利要求1的方法，其中所述温育的预定温度是约23℃至约37℃或更高。11.权利要求1的方法，其中在温育期间混合包含所述多肽的调理的溶液。12.权利要求1的方法，其进一步包括：在所述生物过程中的特定时间点将所述多肽从生物过程移出。13.权利要求12的方法，其进一步包括：在温育之后将所述多肽返回至所述生物过程。14.权利要求1的方法，其中所述生物过程包括分批、半连续或连续生物过程。15.权利要求1的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括生物过程中在生物反应器操作或补料分批细胞培养操作之后的时间点。16.权利要求1的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括其中所述多肽处于包含多个细胞的溶液中的时间点。17.权利要求16的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括其中所述多肽位于包含多个细胞的生物反应器、容纳槽或非生物反应器单元操作容器中的时间点。18.权利要求1的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·科杜里，K·P·布劳尔，V·瓦里库，M·于，C·黄，K·康斯坦丁诺夫，J·尹，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：美国,US