一种目的蛋白制备方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种目的蛋白制备方法及其用途。其制备方法为：目的蛋白核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达；目的蛋白的纯化；纯化产物的切割；所述目的蛋白核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点；所述目的蛋白通过PCR扩增得到，通过引物引入单体切割的识别位点；其中的目的蛋白可以是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽等等。采用本发明专利技术的制备方法制备得到的目的蛋白表达量高、易于纯化、降低了目的蛋白二硫键复性与构象折叠的难度，基因表达产物即为目的蛋白单体，不带额外氨基酸残基，既保证了目的蛋白产物良好的生物学活性，也省去了多拷贝的切割成本，纯化简单，易于大量生产。

【技术实现步骤摘要】
一种目的蛋白制备方法及其用途
本专利技术涉及基因工程技术，特别涉及一种目的蛋白制备方法及其用途。
技术介绍
神经生长因子(NGF)是1951年是由诺贝尔生理学和医学奖获得者R. Levi-Montalcini和S. Cohen在小鼠肉瘤细胞内发现的[1，2]。NGF在神经元的发育、生长、分化以及轴突的生长、递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用。它促进发育中 的交感、感觉神经元的分化和成熟。维持成年交感神经元的正常功能。经典的NGF是从小鼠颌下腺中分离所得的分子量为140000的糖蛋白，由a、P、Y三种肽链按a 20 Y2的比例构成，在NGF三种亚基中，^亚单位是NGF的活性区，因而习惯上所谓的NGF就是指其3亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成二聚体，与人体NGF的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性[3，4]。天然NGF蛋白主要是从成年雄性小鼠颌下腺分离和纯化而得的，方法包括，利用Varon等(1967，1972)的方法通过辅助修饰分离出7s NGF复合物；利用Smith等(1968)的方法分离出7s NGF中的P-NGF亚单位，即用0. 05M,pH 10. 3硼酸钠缓冲液(sodium boratebuffer)(含有 1.5M NaCl)从 CM 纤维柱(CM-cellulose column)上洗脱得到 P-NGF ;利用Bocchini和Angeletti (1969)的方法可制备2. 5s NGF ;利用Smith等(1968)的方法亦可获得7s NGF的a和Y亚单位，较为经典的是Mobley等(1976)的方法。用基因工程方法表达和纯化人神经生长因子，近年来一直备受关注，有报道用昆虫、酵母细胞和大肠杆菌等表达系统表达NGF [5-8]。目前，存在的主要问题是如何提高表达量、易于纯化和保持良好的生物学活性。目前需要一种解决以上问题的蛋白制备方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种提高表达量、易于纯化和保持良好的生物学活性的蛋白制备方法。为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案，包括以下步骤目的蛋白核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达；目的蛋白的纯化；纯化产物的切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点；所述目的蛋白通过PCR扩增得到，通过引物引入单体切割的识别位点；优选的，目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。在纯化之前还包括鉴定蛋白表达的步骤。所述目的蛋白重组表达载体构建中的目的蛋白基因是一个或一个以上拷贝；所述目的蛋白基因的一个以上拷贝数通过将含有一个以上拷贝目的蛋白基因的表达盒与表达载体构建来实现。所述的单体切割的识别位点是根据密码子规则编码的氨基酸序列，优选地，切割位点序列编码为单个氨基酸或两个氨基酸或三个氨基酸或六个氨基酸；更优选地，所述单个氨基酸为R或W或M或D或E或K ;两个氨基酸为D-P或N-G ;三个氨基酸为R-K-R或R-R-R ;六个氨基酸为L-V-P-R-G-S。所述的英文大写字母为氨基酸的代码，比如R表示精氨酸，W表示色氨酸,M表示甲硫氨酸,D表示天冬氨酸,E表示谷氨酸,P表示脯氨酸,N表示天冬酰氨，G表示苷氨酸，K表示赖氨酸，L表示亮氨酸，V表示缬氨酸，S表示丝氨酸。遵守20种氨基酸的密码子表。所述的单体切割的识别位点可通过定点突变目的基因来实现；优选地将人神经生长因子的第158和第213位的甲硫氨酸突变为苏氨酸。 当所述目的蛋白基因是一个以上拷贝时，是以目的蛋白表达盒为单位进入表达载体进行克隆的；优选地，当得到一个拷贝数的重组表达载体时，在此基础上经过酶切连接等手段重组得到两个拷贝数的重组表达载体；依次类推，得到一个以上拷贝数的各重组表达载体。每个单拷贝均含有完整的表达盒，其中包含目的基因、标签蛋白编码序列和各类表达元件的完整操纵子序列，确切的，标签蛋白编码序列包括但不限于6XHis或GST蛋白或MBP蛋白编码序列，表达元件包括启动子、操纵子、核糖体结合位点、多克隆位点和转录终止信号，并且，采用该方法构建P-hNGF串联多拷贝时，具有定向连接特征。所述的表达载体为原核表达系统，优选为pET系统、pGEX系统、pMAL系统；优选地，原核表达系统经过了改造，以使载体上的酶切位点不被相应的酶识别，其中所述酶切位点在后期被用于目的蛋白与表达载体的构建；比如，改造后的PET系统的多克隆位点上的BamHI.Sall和XhoI酶切位点已被消除，且载体转录启动子上游含有BglII酶切位点，而转录终止子下游添加串联的BamHI、SalI和XhoI酶切位点；上述酶切位点在载体上的前后顺序为 XhoI、Sail、BamHI、BglII。所述的目的蛋白的纯化为采用亲和层析柱进行纯化，优选为，亲和层析柱的标签为His标签、GST标签、MBP标签；任选地，所述纯化产物的切割包括化学试剂或酶切割，以获得纯化的目的蛋白重组蛋白；优选地，化学试剂为溴化氰、甲酸或羟胺，酶试剂为胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、弗林蛋白酶、凝血酶或亮氨酸氨肽酶；本专利技术还保护由该方法所得的目的蛋白制品。本专利技术还保护由该方法所得的目的蛋白制品用于医药的用途。本专利技术以人神经生长因子P -hNGF为例来说明本专利技术的方法。本专利技术提供的方法具有普遍应用性，其具有如下设计方案I、设计扩增P -hNGF的特异性引物，从人胎盘中PCR扩增获得P -hNGF基因编码序列。设计的3 -hNGF引物具有如下特征编码链和模板链的5’端上游及3’端下游含有改造后载体MCS的不相同的酶切位点，使得P-hNGF基因能正向插入改造后的原核表达载体中，且插入的P -hNGF基因位于设计的BamHI、Sail和XhoI串联酶切位点之间。2、利用寡核苷酸杂交之后与载体连接的方法消除载体多克隆位点(MCS)的BamHI、Sail和XhoI切点，同时在转录终止子下游引入串联的BamHI、Sail和XhoI酶切位点，该串联酶切位点序列为5’ -CTCGAGTCGACGGATCC-3’。所述改造载体用两对同尾酶(Bglll/BamHI和Sall/Xhol)及T4连接酶多次酶切连接后，可构建P -hNGF定向多拷贝克隆体。3、在P -hNGF基因的5’端上游序列引入切割位点序列，切割位点序列具有如下特征根据密码子规则编码的氨基酸序列可被化学试剂或酶切割。优选的，所述切割位点序列编码为单个氨基酸或两个氨基酸或六个氨基酸，确切的，单个氨基酸为R或W或M或D或E或K ;两个氨基酸为D-P或N-G ;三个氨基酸为R-K-R或R-R-R ;六个氨基酸为L-V-P-R-G-S。4、所述多拷贝构建体亚克隆至原核表达载体中形成原核表达构建体。所述构建体可在原核表达系统中进打原核表达，所述原核表达系统包括pET系统、pGEX系统、pMAL系统等，不排除其他原核表达系统。5、所述原核表达构建体在所述原核表达系统中原核表达后的产物可利用原核表达系统中的标签进行亲和层析纯化，所述标签包括His标签、GST标签、MBP标签等，不排除其他亲和层析标签。6、所述原核表达产物可被化学试剂或酶切割，获得纯化的P-hNGF重组蛋白，确切的，化学试剂包括溴化氰、甲酸和羟胺，酶试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种目的蛋白的制备方法，其特征是：包括如下步骤，目的蛋白核苷酸序列片段的获得；目的蛋白重组表达载体的构建；目的蛋白的诱导表达；目的蛋白的纯化；纯化产物的切割；所述目的蛋白核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点；所述目的蛋白通过PCR扩增得到，通过引物引入单体切割的识别位点；优选的，目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。

【技术特征摘要】
1.一种目的蛋白的制备方法，其特征是包括如下步骤， 目的蛋白核苷酸序列片段的获得； 目的蛋白重组表达载体的构建； 目的蛋白的诱导表达； 目的蛋白的纯化； 纯化产物的切割； 所述目的蛋白核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点； 所述目的蛋白通过PCR扩增得到，通过引物引入单体切割的识别位点； 优选的，目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽。2.权利要求I的制备方法，其特征在于，在纯化之前还包括鉴定蛋白表达的步骤。3.权利要求I或2的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白重组表达载体构建中的目的蛋白基因是一个或一个以上拷贝； 任选地，所述目的蛋白基因的一个以上拷贝数通过将含有一个以上拷贝目的蛋白基因的表达盒与表达载体构建来实现； 任选地，当得到一个拷贝数的重组表达载体时，在此基础上经过酶切连接等方法重组得到两个拷贝数的重组表达载体； 依次类推，得到两个以上拷贝数的各重组表达载体。4.权利要求I或2的制备方法，其特征在于，所述的单体切割的识别位点是根据密码子规则编码的氨基酸序列，优选地，单体切割的识别位点序列编码为单个氨基酸或两个氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：任宏伟，章永磊，邹有土，凡复，汤黎娜，
申请(专利权)人：厦门北大之路生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：