本发明专利技术涉及重组人酸性成纤维细胞生长因子（FGF1），具体是利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法，其包括利用PCR方法扩增后得到人FGF1全长基因PCR产物；将PCR产物用内切酶酶切。本发明专利技术将人酸性成纤维细胞生长因子全长基因克隆至pMAL-p5X表达载体上，重组质粒在大肠杆菌中高效表达含有MBP融合标签的FGF1全长蛋白，该蛋白为可溶性表达，利用MBP亲和层析柱，将带有MBP融合标签的蛋白纯化出来，再利用TEV酶的结合位点，用TEV消化纯化后的融合蛋白，得到完整的不含融合标签的FGF1蛋白，不仅可溶性较高，而且产品纯度较高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组人酸性成纤维细胞生长因子(FGF1)，具体是利用大肠杆菌制备FGFl全长蛋白的方法。
技术介绍
人酸性成纤维生长因子(FGFl)是已知FGF家族中的成员，为中胚层和神经外胚层来源的有丝分裂原，具有促进血管生成、神经元再生和存活、骨或软骨组织修复及成肌细胞分化等多种生物学功能。一般来说，FGFl的化学特征是可与肝素紧密结合，其等电点呈酸性。已知肝素可通过几种方式调节FGF分子的功能，例如肝素或肝素样分子可直接作用于FGF,激活或增强FGFl的活性。另外，发现可溶性肝素的增效作用似乎对FGFl有选择性，同时，肝素样物质也是FGF特别是FGFl的优选稳定剂。FGF I的独特的血管成活性和细胞增殖活性使之特别适用于促进组织特别是深部伤口的愈合。FGFl也在待治疗的损伤部位，特别是在大部分处于酸性环境的损伤部位，FGFl可发挥其温和而持久的生物学活性，从而有利于其在临床上的应用。目前存在多种以重组DNA技术生产FGFl的方法，如一些已构建了很多改良的重组表达系统，还有一些具有提高生物学活性和稳定性的FGF I类似物或突变体，但整合形式的全长度FGFl的活性要比去除了 N末端部分氨基的其他形式的FGFl的活性高，且这些现有技术的FGFl蛋白有些含有融合标签，可溶性不高，产品纯度也较低。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种不含有融合标签，可溶性较高，产品纯度较高的利用大肠杆菌制备FGFl全长蛋白的方法。本专利技术解决上述技术问题采用的技术方案为利用大肠杆菌制备FGFl全长蛋白的方法，包括(I)利用PCR方法，从人胎脑的Quick Clone cDNA中扩增人FGFl的全编码序列，扩增后得到目的片段大小为468bp，用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物；(2)将上述PCR产物用内切酶酶切，得到N端有BamH I、C端有Hind III粘性末端的酶切片段，回收后将该酶切片段连接至BamH I和Hind III消化好的pMAL_p5X表达载体；(3)将上述连产物转化至大肠杆菌DH5a，经培养抽提、测序、分析后，得到测序正确的人FGFl全长cDNA序列的重组质粒；(4)将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21，进行培养、诱导表达后离心、洗涤、裂解并收集细菌沉淀；(5)重悬上述细菌沉淀，加入MgCl2溶液，离心得到上清，在上清中加入TriS-Cl后用过滤器过滤、透析，得到含有MBP融合标签的FGFl全长蛋白；(6)将透析后的液体上到直链淀粉琼脂糖柱上，用洗涤缓冲液冲洗后用洗脱缓冲液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱的蛋白；(7)将上述收集到的蛋白进行TEV酶切，孵育后将酶切蛋白液又一次上到直链淀粉琼脂糖柱上，收集上样后流出的液体；(8)将上述上样后流出的液体再次上样于Ni-NTA层析柱，过滤再次上样后流出的液体，得到纯化后的FGFl全长蛋白。作为优选，步骤(3)的连接产物转化至大肠杆菌DH5a，平板倒置培养16h后，挑取单克隆培养；质粒抽提后，用BamH I进行克隆鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行sanger法测序，得到测序正确的重组质粒。作为优选，步骤(4)是在37°C培养4h后进行诱导表达。作为优选，所述诱导表达是在0D500为0. 6、IPTG为ImM的条件下进行。作为优选，所述诱导表达后进行离心，将细菌沉淀重悬于细胞洗涤缓冲液中，在4°C、5500rpm条件下离心；再将沉淀重悬于细胞裂解液中，加入PMSF室温搅动，于4°C以 12000rpm离心后，收集细菌沉淀。作为优选，步骤(5)在重悬收集的细菌沉淀时，加入4°C预冷的MgCl2溶液，4°C搅动，12000rpm离心，在离心得到的上清中加入Tri s-Cl (pH7. I)至pH达到7. 1，上清用过滤器过滤后，在4°C的条件下透析，得到含有MBP融合标签的FGFl全长蛋白。从以上技术方案可知，本专利技术将人酸性成纤维细胞生长因子全长基因克隆至pMAL-p5X表达载体上，重组质粒在大肠杆菌中高效表达含有MBP融合标签的FGFl全长蛋白，该蛋白为可溶性表达，利用MBP亲和层析柱，将带有MBP融合标签的蛋白纯化出来，再利用TEV酶的结合位点，用TEV消化纯化后的融合蛋白，得到完整的不含融合标签的FGFl蛋白，不仅可溶性较高，而且产品纯度较高。附图说明图I中M为蛋白质分子量标准；1为经过MBP标签纯化,并去除标签后的FGFl蛋白。具体实施例方式下面对本专利技术作进一步地详细说明本方法首先根据NCBI的genbank数据库中NM_000800. 4设计两条FGFl的引物，如下F-gccgtctcggatccgaaaacctgtattttcagggcatggctgaaggggaaatcaccR-gccgtctcaagcttaatcagaagagactggcagggggag利用PCR方法，从人胎脑的Quick Clone cDNA中扩增人FGFl的全编码序列，扩增条件为95°C 5min, (94°C lmin,52°C 30sec,72°C 30sec) 35 个循环，72°C 7min。扩增后得到目的片段大小为468bp，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。接着将上述PCR产物用内切酶酶切，得到N端有BamH I、C端有Hind III粘性末端的酶切片段，回收后将该酶切片段连接至BamH I和Hind III消化好的pMAL_p5X表达载体。然后将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5a，平板倒置培养16h后，挑取单克隆培养；质粒抽提后，用BamH I进行克隆鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行sanger法测序,对比测序序列，得到测序正确的人FGFl全长cDNA序列的重组质粒，其基因序列如下I ATGGCTGAAGGGGAAATCACCACCTTCACAGCCCTGACCGAGAAGTTTAATCTGCCTCCAI -M-A—E—G—E—I—T—T—F—T—A—L—T—E—K—F—N—L—P—P-6I GGGAATTACAAGAAGCCCAAACTCCTCTACTGTAGCAACGGGGGCCACTTCCTGAGGATC 21 -G-N—Y—K—K—P—K—L—L—Y—C—S—N—G—G—H—F—L—R—1-I2I CTTCCGGATGGCACAGTGGATGGGACAAGGGACAGGAGCGACCAGCACATTCAGCTGCAG41 -L—P—D—G—T—V—D—G—T—R—D—R—S—D—Q—H—I—Q-L-Q-181 CTCAGTGCGGAAAGCGTGGGGGAGGTGTATATAAAGAGTACCGAGACTGGCCAGTACTTG 61 -L-S—A—E—S—V—G—E—V—Y—I—K—S—T—E—T—G—Q—Y—L-24I GCCATGGACACCGACGGGCTTTTATACGGCTCACAGACACCAAATGAGGAATGTTTGTTC81 -A—M—D—T—D—G—L—L—Y—G—S—Q—T—P—N—E—E—C—L—F-30I CTGGAAAGGCTGGAGGAGAACCATTACAACACCTATATATCCAAGAAGCATGCAGAGAAG101 -L-E—R—L—E—E—N—H—Y—N—T—Y—I—S—K—K—H—A-E-K-36I本文档来自技高网...
【技术保护点】
利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法，包括：（1）利用PCR方法，从人胎脑的Quick?Clone?cDNA中扩增人FGF1的全编码序列，扩增后得到目的片段大小为468bp，用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物；（2）将上述PCR产物用内切酶酶切，得到N端有BamHⅠ、C端有HindⅢ粘性末端的酶切片段，回收后将该酶切片段连接至BamHⅠ和Hind?Ⅲ消化好的pMAL?p5X表达载体；（3）将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5a，经培养抽提、测序、分析后，得到测序正确的人FGF1全长cDNA序列的重组质粒；（4）将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌?BL21，进行培养、诱导表达后离心、洗涤、裂解并收集细菌沉淀；（5）重悬上述细菌沉淀,?加入MgCl2溶液，离心得到上清，在上清中加入Tris?Cl后用过滤器过滤、透析，得到含有MBP融合标签的FGF1全长蛋白；（6）将透析后的液体上到直链淀粉琼脂糖柱上，用洗涤缓冲液冲洗后用洗脱缓冲液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱的蛋白；（7）将上述收集到的蛋白进行TEV酶切，孵育后将酶切蛋白液又一次上到直链淀粉琼脂糖柱上，收集上样后流出的液体；（8）将上述上样后流出的液体再次上样于Ni?NTA层析柱，过滤再次上样后流出的液体，得到纯化后的FGF1全长蛋白。...
【技术特征摘要】
1.利用大肠杆菌制备FGFl全长蛋白的方法，包括(1)利用PCR方法，从人胎脑的QuickClone cDNA中扩增人FGFl的全编码序列，扩增后得到目的片段大小为468bp，用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物；(2)将上述PCR产物用内切酶酶切，得到N端有BamHI、C端有Hind III粘性末端的酶切片段，回收后将该酶切片段连接至BamH I和Hind III消化好的pMAL_p5X表达载体；(3)将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5a，经培养抽提、测序、分析后，得到测序正确的人FGFl全长cDNA序列的重组质粒；(4)将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21，进行培养、诱导表达后离心、洗涤、 裂解并收集细菌沉淀；(5)重悬上述细菌沉淀，加入MgCl2溶液，离心得到上清，在上清中加入Tris-Cl后用过滤器过滤、透析，得到含有MBP融合标签的FGFl全长蛋白；(6)将透析后的液体上到直链淀粉琼脂糖柱上，用洗涤缓冲液冲洗后用洗脱缓冲液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱的蛋白；(7)将上述收集到的蛋白进行TEV酶切，孵育后将酶切蛋白液又一次上到直链淀粉琼脂糖柱上，收集上样后流出的液体； (8)将上述上样后流出的液体再次上样于Ni-NT...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘艺，熊丹，刘金蕾，
申请(专利权)人：赵谦，
类型：发明
国别省市：
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