本发明专利技术涉及一种多角体基因前60bp片段及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术主要是在常用的表达载体中利用多角体基因前60bp片段和外源基因EGFP进行融合表达，同时与全长多角体融合表达方法比对。本发明专利技术中的融合表达方法在具有全长多角体性质的同时，还降低了溶解融合蛋白所需溶液的pH值，使融合蛋白在中性缓冲液中即可溶解，并适用于蛋白酶等酶切反应的进行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对一种多角体基因前60bp片段及其应用，属于生物
技术介绍
大肠杆菌表达系统目前是应用最广泛的蛋白表达系统之一，其具有成本低廉、生产率高、操作简单等优点。该系统主要有表达载体、表达宿主菌、表达条件等组成。目前，越来越多的研究人员关注于融合表达载体的应用，研究成功的融合表达载体主要有=GST (谷光甘肽-S-转移酶)系统、半乳糖苷酶系统、麦芽糖结合蛋白(MBP)系统、蛋白A系统、纯化标签融合系统等。家香(βοπ γχ mori)多角体蛋白(Polyhedrin, Polh)基因共有738个核苷酸,编 码由245个氨基酸组成的大小为29 kD的多肽。它是多角体的主要结构成份；多角体蛋白构成的蛋白质晶体对包埋在其中的病毒体具有保护作用，它使病毒体在自然环境中保持稳定和侵染能力。多角体蛋白基因是一个超表达极晚期基因。在病毒感染的晚期，当其它病毒基因和宿主基因关闭后，此基因能持续高水平表达，在受感染细胞内产生的多角体蛋白的量可达细胞蛋白质总量的25% -50%。近20年来,人们都致力于研究多角体蛋白基因的高效表达机制，并且利用它的这种特性使许多外源基因得到了高效表达，尤其是一些难以表达的蛋白例如膜蛋白。家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白具有它独特的性质，在大肠杆菌中表达的多角体蛋白在中性PH条件下以包涵体的形式存在，只有在碱性条件(pH10. 8及以上)下可溶，并且这种多角体蛋白具有与天然多角体蛋白晶体相同的性质。因此，可将目的蛋白基因与其融合表达，一方面能提高目的蛋白的表达量，另一方面，通过简单的PH梯度洗脱和差速离心的方法就可以获得较纯的融合蛋白，再经过特异性蛋白酶酶切消化，回收得到较纯的目的蛋白。张耀洲等在纯化标签融合系统上进行改造，将具有高效表达的能力多角体蛋白作为一种标签，将不表达或者难表达的蛋白基因融合上去，从而使其表达或者提高其表达量。同时，利用多角体的溶解特性，通过简单的PH调节和差速离心的方法得到比较纯的融合蛋白，之后进行蛋白酶切得到纯的目的蛋白。但是，蛋白酶的最佳作用pH范围在7. 0-8. 5，而多角体蛋白只有在ρΗΙΟ. 8时才会溶解，所以在这一条件下进行酶切时，蛋白酶丧失活性或者无法达到最大活性，所得到的目的蛋白的量也受到限制。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种多角体基因前60bp片段及其应用。本专利技术通过在常用载体的基础上，插入该多角体蛋白基因前60bp片段，后面可继续克隆上外源基因，用于融合表达；表达出来的融合蛋白，可用调节PH值的方法等进行快速纯化该目的蛋白，还能在低pH值(pH7. 6)下溶解，所溶解的pH值符合一般蛋白酶反应需要的条件。本专利技术的技术方案如下 本专利技术提供一种多角体基因前60bp片段，其碱基序列如SEQ ID NO: I所示。本专利技术还提供上述多角体基因前60bp片段在表达融合蛋白及降低其溶解性中的应用。本专利技术还提供上述多角体基因前60bp片段与蛋白酶酶切位点连接而成的重组基因，其碱基序列如SEQ ID N0:2所示。进一步地，其中所述蛋白酶为凝血酶。本专利技术还提供一种含上述多角体基因前60bp片段的重组载体。进一步地，其中所述重组载体由多角体基因前60bp片段与转移载体构建而成。进一步地，其中所述转移载体为pET22b、pET28a、pET28b、pET28c、pET32a、pcDNA3或 pFastBac 。 进一步地，其中所述转移载体为pET28a。本专利技术进一步提供一种含上述多角体基因前60bp片段的基因工程菌。进一步地，其中所述基因工程菌为大肠杆菌。本专利技术主要是在常用的表达载体中利用多角体基因前60bp片段(polh60)和外源基因产进行融合表达，同时与全长多角体融合方式比对。本专利技术中的融合方式在具有全长多角体性质的同时，还降低了溶解融合蛋白所需溶液的PH值，使融合蛋白在中性缓冲液中即可溶解，并适用于蛋白酶等酶切反应的进行。附图说明图I是本专利技术构建的重组表达载体的质粒 图2是本专利技术多角体基因前60bp片段的PCR产物电泳图；其中，M:核酸分子量标准；I :目的基因PCR产物； 图3是本专利技术的重组表达载体鉴定图；其中，M:核酸分子量标准；1 基因PCR产物；2 :重组质粒EcoR I和Xho I的酶切产物； 图4是本专利技术的融合蛋白表达图；M :蛋白分子量标准；I:疋coli BL21pET28a-/ o从仰-從FZ7未诱导；2: B. coli BL21 v^28a-polh60_EGFPfl导:E. coli BL21成mpolh60-EGFP 潘导;4: B. coli BL21 pET28a_從F/7 诱导； 图5是本专利技术的融合蛋白溶解性分析图；其中，1、3、5、7、9、11、13是溶液pH为8.0、8.4,9. 2,9. 6,10. ,10. 4,10. 8 时的上清;2、4、6、8、10、12、14 是溶液 pH 为 8. 0,8. 4,9. 2、9.6、10. ,10. 4、10. 8 时的沉淀； 图6是本专利技术使用Gly回调pH值至7. 6时的电泳图；其中，M:蛋白分子量标准；1ρΗ7. 6时的上清蛋白样品；2 pH7. 6时的沉淀中蛋白样品； 图7是本专利技术的凝血酶酶切效果图；其中，M:蛋白分子量标准；1:ρΗ7. 6时的上清原样；2 pH7. 6时凝血酶酶切后的样品。具体实施例方式应该指出，以下具体说明都是事例性的，旨在对本专利技术提供进一步说明，除非另有说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有与本专利技术所属
人员通常理解的相同含义。下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明。以下实施例中使用的生物材料如家蚕核型多角体病毒、载体pET-28a、质粒pGEX-4T-l-從F八质粒pET28a_/7o7A和疋coliTGl^. coli BL21 (DE3)均购自特菲(天津)生物医药科技有限公司；所使用的反应试剂如无特殊说明，均为Fermentas公司产品。实施例I :构建重组载体pET28a_/7o7A仰 I)以质粒pET28a-/7o7A为模板扩增多角体基因前60bp的片段，引物设计如下 上游引物Fl: 5’7TCATGGCCAATTATTCATAC-3’ (斜体表示 I 酶切位点) 下游引物Rl 5’- GGCfi^ 7T<XTCGTTCCTCGTGGTTCTATATTTATTGTCGTACACG-3’ (斜体表示I酶切位点，下划线部分为凝血酶酶切位点)。·2) PCR反应参数设计为，94 °C预变性5min，94°C变性30s，59°C退火30s，72°C复性延伸lmin, 30个循环，72°C延伸IOmin0在100 μ L的离心管中，加入下列组分双蒸水_33 μ L IOXTaqBufferI 5 μ L 2mMdNTPs_ 5 μ LFl(IQuM)~1. 5uLRl(IQuM)~1. 5uL 质粒 pET28a-po从 _ 2. 5 μ L TaqDNApolymerase I.5 μ L Total50 μ L 各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。3)上述步骤2)得到的PCR产物经及I和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多角体基因前60bp片段，其碱基序列如SEQ?ID?NO:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，耿文杰，舒特俊，陈剑清，
申请(专利权)人：天津耀宇生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。