黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法：以黄绿蜜环菌子实体为原料，磨成粉末后乙酸乙酯提取，浓缩至膏状；用正己烷-乙醇溶剂溶；一维液相色谱分离：采用Silica色谱柱，A相正己烷、B相乙醇二元流动相，B相浓度由0％至75％梯度洗脱，收集23-26min洗脱液；用乙醇-正己烷溶剂溶解；二维液相色谱分离：采用Silica色谱柱，A相正己烷、B相乙醇二元流动相，B相浓度4％等度洗脱，收集13-18min洗脱液，蒸发浓缩，得大豆素。该分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，成本低，大豆素提取率高；目的物对肺癌A549细胞和肝癌Hep-G2细胞具有抑制作用，具有抗癌药物开发潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物化学及生物医药
，具体涉及一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，以及该大豆素单体化合物在制备抗肝癌药物和抗肺癌药物中的应用。
技术介绍
黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-rivens)，又名黄蘑菇、金蘑菇、黄环菌，隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。黄绿蜜环菌子实体中等大，菌盖扁半球形至平展，直径5-12cm，菌盖边缘内卷，表皮开裂形成近环状排列的纤毛状后磷片。菌褶近似菌盖色，稍密，弯生，不等长。菌柄柱形，茎部膨大，长2-10cm，直径2-2.5cm，白色或或带黄色，内实。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色鳞片。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，担孢子棒状，无色，具4个孢子，菌丝具明显锁状联合。菌丝分布在土壤5-10cm。该菌夏秋季生于针叶林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌丝可与主要植被为嵩草和高山杂类草等形成菌根。在牧草生长季节，由黄绿蜜环菌菌丝顶端生长，在草地上形成或大或小的圆圈、半圆或条带状的蘑菇圈。圈的宽度大约为50cm，圈的直径大约6cm左右(周连玉.黄绿蜜环菌的研究概述.安徽农学通报[J].2010,16(3):52-54)。国内对黄绿蜜环菌营养成分进行了初步分析，富含氨基酸、蛋白质、多糖多肽等营养和药用成分，具有较高的保健和药用价值。但目前的蜜环菌制剂主要以初提混合物为原料，如郭顺星等在“蜜环菌的化学成分及应用研究”(微生物学通报[J].1996,23(4):239-240)中提出：蜜环菌糖浆以蜜环菌培养液(菌丝连同发酵液)为主要原料，煮沸浓缩制成，主治眩晕头痛，神经衰弱，失眠，美尼尔综合症；蜜环菌浸膏以菌丝体为原料，煮沸、过滤，残渣醇析，醇析物与滤液合并浓缩制成，用于治疗血管性头痛、神经衰弱、冠心病、脑动脉血管硬化等病；蜜环菌片以菌丝体烤干后磨成细粉压片而成，对高胆固醇血症、高甘油三酯血症、降低血压有一定效果。由于蜜环菌制剂成分一般为混合物，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，所以其缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。可见，对黄绿蜜环菌的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。袁兴利等在“蜜环菌的化学成分研究”(中国中药杂志[J].2013,38(16):2671-2674)提出以蜜环菌发酵培养物(包含菌丝体和发酵液)为原料进行有效成分提取：采用95％乙醇浸提后，用闪式提取器提取，合并提取液并浓缩；经两次硅胶柱色谱和一次SephadexLH-20色谱柱，并使用不同的洗脱剂进行分离纯化后，得到大豆素(化学名5,7-二羟基-3-(4-羟苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮、4',5,7-三羟基异黄酮)单体化合物。但是使用该方法步骤繁琐，成本高，得到的大豆素含量极少，得率比较低，3.5kg干燥的蜜环菌发酵培养物只得到10mg大豆素，这大大限制了大豆素的进一步研究和应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，该方法采用二维高效液相色谱进行分离纯化，得到具有生物活性的大豆素单体化合物，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时，成本低，大豆素提取率高。本专利技术所采用的技术方案为：一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，该方法包括以下步骤：(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL︰1g进行浸泡24-48h，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；(2)使用乙醇体积分数为10-35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％(即按体积百分比B相75％、A相25％混合而成的液体，下同理)进行梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集23-26分钟洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；(4)用乙醇体积分数为2-15％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为500-2000μL/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为B相浓度4％进行等度洗脱20-30min，根据紫外吸收光谱收集13-18分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到大豆素单体化合物。所述步骤(3)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。所述步骤(5)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。本专利技术还进一步提供上述提取得到的大豆素单体化合物在制备抗肺癌药物中的应用。该大豆素单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。本专利技术进一步提供上述提取得到的大豆素单体化合物在制备抗肝癌药物中的应用。该大豆素单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。按照本领域普通技术人员的理解，大豆素单体化合物的给药剂量应根据治疗对象的年龄、体重、疾病严重程度等因素而定，一般可以是0.35-1.26mg/天。本专利技术采用二维液相色谱技术进行从黄绿蜜环菌中分离纯化大豆素：首先：由于大豆素为苷元，极性非常小，所以粗提选用乙酸乙酯进行相似相溶提取，该溶剂可以尽可能多地溶解目的组分，且乙酸乙酯为脂溶性溶剂，与其相似相溶的目的组分也应该具备进入生物活性细胞所必需的脂溶性特性，从而具有更高的进入细胞参与细胞内作用的可能性；其次，在一维分离的条件选择上：多次试验结果显示，Silica正相硅胶色谱柱对所提物质分离效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5‑10)mL︰1g进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；(2)使用乙醇体积分数为10‑35％的正己烷‑乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100‑150mg/mL的上样溶液；(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为50‑150mL/针，流动相流速为550‑600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210‑260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱45‑75min，根据紫外吸收光谱收集23‑26分钟洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；(4)用乙醇体积分数为2‑15％的乙醇‑正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50‑100mg/mL；(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为500‑2000μL/针，流动相流速为10‑30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210‑260nm，采用的洗脱方式为B相浓度4％进行等度洗脱20‑30min，根据紫外吸收光谱收集13‑18分钟洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到大豆素单体化合物。...

【技术特征摘要】
1.一种黄绿蜜环菌中大豆素单体化合物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比
(5-10)mL︰1g进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；
(2)使用乙醇体积分数为10-35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到
的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；
(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，
采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为50-150mL/
针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用
的洗脱方式为B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集
23-26分钟洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；
(4)用乙醇体积分数为2-15％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶
解至浓度为50-100mg/mL；
(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，王欢欢，庞莉，韩朝，李上文，马红，杨珊珊，陆洪，杜思邈，盖其静，
申请(专利权)人：天津耀宇生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12