一株蜜环菌YN01（WT）及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株蜜环菌（

A strain of Armillaria YN01 (WT) and its application

The present invention discloses a strain of Armillaria mellea (

【技术实现步骤摘要】
一株蜜环菌YN01（WT）及其应用
本专利技术涉及一株蜜环菌YN01（WT）及其应用，属于微生物

技术介绍
蜜环菌（Armillariamellea），隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、蜜环菌属，广泛分布于世界各地林区。具有清目、利肺、益肠胃、抗痉挛、镇静、扩张血管、降血压等作用，且子实体、菌丝、菌索均可入药。蜜环菌是一类具有重要经济价值的高等真菌，也是名贵中药材天麻、猪苓的共生菌。蜜环菌对天麻幼苗的形成、营养器官的生长以及营养生长向生殖生长转化都起决定性的作用。众所周知，昭通天麻享誉国际，上世纪50年代，昭通地区已经开始进行天麻的无性繁殖，现已广泛实行规模化种植，2011年至2014年，昭通全市累计完成天麻种植24.09万亩、产量7455万公斤；但是天麻市场依然供不应求，天麻种植前景广阔；目前市场上销售的天麻共生蜜环菌存在商业种来源不明、分类混乱等问题，这不仅不利于科学合理的开发利用蜜环菌资源，对于天麻的人工栽培也非常不利；昭通天麻共生密环菌在基础研究方面亦是一片空白。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一株从云南昭通乌天麻中分离到的蜜环菌（Armillariamellea）YN01（WT），其已于2016年11年2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是：中国，武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCCNO：M2016611。本专利技术通过对筛选分离到的蜜环菌的生理活性进行研究，通过rDND-IGS序列的比对确定其为蜜环菌（Armillariamellea），该菌株保存培养基为PDA培养基（去皮马铃薯200g煮汁、葡萄糖20g、琼脂15g、水1000mL、pH自然），活化所用的培养基为改良加富PDA培养基（去皮马铃薯400g煮汁、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、蛋白胨9g、硫酸镁1.5g、琼脂15g、维生素B20.02g、水1000mL、pH自然）。本专利技术提供的蜜环菌萌发快，生长迅速，生长力强，与菌材共培养时间短，可缩短天麻生产的周期。本专利技术中蜜环菌菌株具有以下微生物学特征：（1）形态学特征在PDA液体培养基中培养，形成白色菌丝球，直接0.8-1.5cm，不分泌色素；在PDA固体培养基上培养，菌株分化出表明菌丝和菌索两种形态；新生菌丝极为纤细，色白，菌丝稠密，菌落直径1-3cm，与培养基连接紧密；新生菌索白色，顶端多二分叉，菌索多竖直延伸，在黑暗中可见蓝绿色荧光；适宜培养温度为25℃。（2）生理生化特征碳源液体培养基制备：保持培养基中碳含量等量，分别在150mL基础培养基（去皮马铃薯200g煮汁、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、水1000mL、pH自然）中加入常见碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖各20g，制成不同的碳源培养基，每个碳源3次重复；表1：蜜环菌YN1的碳源利用试验结果注：表中“+”表示可利用，“-”表示不可利用。B、蜜环菌的氮源利用情况氮源液体培养基制备：保持培养基中氮含量等量，分别在150mL基础培养基（去皮马铃薯200g煮汁、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、水1000mL、pH自然）中加入常见氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、氯化铵、碳酸氢铵各20g，制成不同的氮源培养基，每个氮源3次重复；表2：蜜环菌菌株的氮源利用试验结果注：表中“+”表示可利用，“-”表示不可利用。（3）分子鉴定a、提取总DNA：采用CTAB法提取DNA，取0.01g冻干菌丝体，加入2×CTAB提取液500μl，充分研磨；65℃水浴1h；加入等体积的氯仿/Tris-饱和酚（1:1）混合液，13000r/min离心10min；取上清于一新离心管中，加等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），13000r/min离心10min；取上清，于上清中加入3mol/L醋酸钾80μl,加等体积冰冷的异戊醇，混匀后置于-20℃冰箱中沉淀1h，13000r/min离心10min；弃上清，收集沉淀；体积浓度75%酒精冲洗，超净台真空干燥；20μlTE溶解DNA,-20℃保存备用；b、rDNA-ITS的扩增：以总DNA为模版进行PCR反应，反应采用通用引物ITS1F和ITS4R扩增目的片段，引物序列为ITS1F：5,-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3,；ITS4R:5,-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3,，PCR反应体系(25uL):10×PCRBuffer2.5μL、dNTP(各l0mmol/L)1.0μL、模板DNA溶液1.0μL、5U/μL的Taq酶0.3μL、10μmol/L的ITS1F和ITS4R引物各1uL，加超纯水补足。PCR反应条件:95℃，3min；95℃，30s；54℃，60s；72℃,2min；35个循环；72℃延伸，10min。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的DNA片段，用试剂盒（Biomiga；Gel/PCRExtractionKitDC3511-01）回收目的DNA片段。c、rDNA-IGS的扩增：以rDNA-ITS序列为模版进行PCR反应，反应采用通用引物5SA和CNL12扩增目的片段；引物序列为5SA：5,-CAGAGTCCTATGGCCGTGGAT-3，CNL1:5,-CTGAACGCCTCTAAGTCAG-3，PCR反应体系(25uL):10×PCRBuffer2.5μL、dNTP(各l0mmol/L)1.0μL、模板DNA溶液1.0μL、5U/μL的Taq酶0.3μL、10μmol/L的ITS1l和ITS4引物各1μL,加超纯水补足。PCR反应条件:94℃，10min；94℃，40s；54℃，60s；72℃,2min；35个循环；72℃延伸，10min。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的DNA片段，用试剂盒（Biomiga；Gel/PCRExtractionKitDC3511-01）回收目的DNA片段。d、TA克隆及测序：按PmdTM18-TVectorCloningKit试剂盒(TaKaRa)的操作方法将纯化回收的PCR产物连接到18-T载体上，转入感受态细胞DH5α中，活化1h后涂布于含有抗生素的LB固体培养基中，37℃倒置培养过夜后挑选阳性克隆菌落于含有氨苄的LB液体培养基培养4h，菌液PCR检测阳性克隆后，进行双向测序；每个菌株测序时设两个重复；e、序列分析：实验获得rDNA-IGS序列（如SEQIDNO：1所示），将所得扩增片段进行测序，测序结果在NCBI上进行Blast分析。结果表明，该菌与其他蜜环菌相似度均在99%以下；为构建这株蜜环菌的系统发育树，从NCBI上下载其他蜜环菌菌株的相关序列，其中包括3株产地为贵州的天麻共生蜜环菌（KJ643360、KJ643361、KJ643372）、3株与猪苓共生蜜环菌（KP162279、KP162282、KP162285）、1株产地为云南的天麻共生菌（KC844230）和产地来自欧洲、日本和不丹等地的蜜环菌共13株，构建系统进化树（见图1）。结果表明，该蜜环菌与其他蜜环菌亲缘关系较远，说明多种蜜环菌能与天麻形成共生关系。本专利技术另一目的是将上述菌株应用在天麻人工繁殖中。本专利技术的有益效果在于：通过对一株昭通乌天麻共生的蜜环菌的生理活性进行研究，用分子生物学方法确定它的分类地位；证本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株蜜环菌（

【技术特征摘要】
1.一株蜜环菌（Armillariamellea）YN01（WT），其在中国典型培养物保藏中心...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昆志，包燚，操璟璟，雷玉珠，陈丽梅，徐慧妮，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53