一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法。本发明专利技术的特征在于利用In‑cell Western(ICW)法简便、直观地检测被HTNV感染的细胞。该方法检测灵敏度高(可检测5g的目的蛋白)、周期短(72小时)、结果判读客观、可重复性好、高通量、方法可标准化，便于实验室间推广，特别可针对无细胞病变效应病毒检测其感染力。本发明专利技术同时公布了上述方法在HTNV感染力测定(TCID

Method for high throughput rapid detection of neutralizing antibody titer of Hantaan virus

The invention discloses a method for detecting the neutralizing antibody titer of Hantaan virus by high throughput and fast. The invention is characterized in that the use of In cell Western (ICW) cell method is simple and intuitive to detect infection by HTNV. The method of high sensitivity (detection 5g protein) and short period (72 hours), the interpretation of the results of objective, good repeatability, high throughput, can be standardized, to facilitate inter laboratory promotion, especially for no cytopathic effect the infectivity of virus detection. The invention also discloses the method for measuring the infectivity of HTNV (TCID

【技术实现步骤摘要】
一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法
本专利技术属于汉滩病毒检测
，涉及一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法。
技术介绍
汉滩病毒(Hantaanvirus,HTNV)隶属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus)，是单股负链RNA病毒，基因组由L、M、S三个片段组成，分别编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、包膜糖蛋白(GP)和核衣壳蛋白(NP)。该病毒的宿主动物和传染源均为啮齿动物，主要通过动物排泄物污染而经由呼吸道、消化道或破损的皮肤等途径传播给人类，引起一类自然疫源性疾病，即肾综合征出血热(Hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)。该病临床表现为发热、出血和急性肾功能损害，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家，每年发病人数占世界总发病数90％以上，死亡率为0.1-15％。据文献报道，1950-2007年间，我国共发生1,557,622例HFRS，其中死亡46,427例，死亡率约为3％；另据中国疾病预防控制中心统计，2015年我国全年共发生10,812例HFRS，死亡63例。由于HTNV的宿主广泛，传播途径多，且目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物，因此其防治任务十分艰巨。值得注意的是，HTNV还是国际《禁止生物武器公约》所列入的生物战剂，对未来军事活动构成潜在的威胁。开发、研制HTNV预防性疫苗被认为是预防HTNV感染所致HFRS的最根本手段，而预防性疫苗成功与否的关键是其能否诱导有效的体液免疫。高滴度HTNV中和抗体可有效抵抗外来HTNV的感染，因此建立稳定、有效的疫苗评价系统，检测疫苗免疫反应的保护效果，对于疫苗的研制和质控具有重要意义。中和试验(neutralizationtest)是指病毒与相应的抗体结合,抗体中和病毒使其失去了对敏感细胞的感染力，该实验可从待检血清中检出抗体,或从病检样本中检出病毒,从而诊断病毒性传染病，也可测定抗病毒血清中和效价，或者对新分离病毒进行鉴定和分型。其原理是特异性的抗病毒免疫血清(中和抗体)与病毒作用,能够抑制病毒对敏感细胞的吸附、穿入和脱壳,从而阻止了病毒的繁殖,失去了感染能力。值得注意的是，该反应不仅表现为质的方面,即一种病毒只能被相应的免疫血清中和；而且也表现在量的方面,即中和一定量病毒的感染力,需要一定效价的抗体。通过中和试验检测病毒中和抗体效价是评价疫苗保护效果的常用方法。常用的中和试验包括简单定性法、固定样本稀释病毒法、固定病毒稀释样本法及空斑减少法。空斑减少法是“金标准”，即用系列稀释的患者血清与等量的已知滴度病毒悬液(100TCID50)混合，在室温下作用一段时间后接种敏感细胞进行培养，以能保护半数细胞培养孔不产生细胞病变(CPE)的血清最高稀释度作为终点效价。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，通过In-cellWestern(ICW)技术检测HTNV感染细胞内的病毒核衣壳蛋白，并基于此测定HTNV滴度，具有测灵敏度高、周期短的优势。本专利技术是通过以下技术方案来实现：一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，包括以下操作：1)将A549细胞均匀接种于ICW用微孔板中，培养至80～90％的细胞汇合度；2)待步骤1)中细胞汇合度达到70～80％时，采用固定病毒稀释样本的方法进行混合液的制备：将待测样本等比梯度稀释，每个稀释比例的待测样本分别与等体积的HTNV混合，于37℃孵箱中孵育2h，期间轻柔地颠倒混匀数次；3)吸弃步骤1)微孔板中的培养液，每孔加入DPBS洗涤1-2次，然后将步骤(2)中孵育完成的混合液加入微孔板，每个稀释梯度设多个重复样，加样顺序按照从低到高进行；同时设置病毒阴性对照组、同型对照组、病毒阳性对照组、空白对照组；4)将步骤(3)中的微孔板放入37℃孵箱孵育2.5h后吸弃混合液，每孔加入洗涤1-2次，再向每孔加入含有2％FBS的DMEM；5)将步骤4)中微孔板放入37℃孵箱孵育2d后取出进行ICW检测；6)ICW检测HTNV感染细胞内的NP：首先吸弃微孔板中的培养液，加入PBS洗涤；然后向每孔中加入4℃预冷的固定缓冲液进行固定，免摇动在室温条件下孵育；吸弃固定缓冲液，用透膜缓冲液洗脱细胞；吸弃透膜缓冲液，沿管壁向每孔加入封阻液，在摇床上缓慢上摇动室温下孵育；吸弃封阻液，沿管壁向每孔加入一抗，室温下缓慢摇动孵育；吸弃一抗，加入洗涤缓冲液，洗涤多次；吸弃洗涤缓冲液，沿管壁向每孔加入二抗，室温下避光缓慢摇动，孵育；加入洗涤缓冲液，室温下避光缓慢摇动，洗涤多次；洗脱结束之后，完全去除洗脱液；最后，洗脱后的微孔板采用近红外双色荧光成像系统进行扫描，使用700nm和800nm两个通道同时扫描，以获取HTNVNP的红外荧光强度；7)计算HTNV中和抗体效价：获得每孔在700nm和800nm通道的红外荧光强度，然后计算每孔中HTNVNP红外荧光强度相对比NIR，NIR＝NP荧光值/内参蛋白荧光值；再利用Karber方法计算获得待测样本中和滴度，即中和抗体效价。所述用Karber方法计算待测样本中和滴度具体为：1)计算各病毒稀释度阳性孔数目P和阴性孔数目N，阳性孔的判别标准为，若该孔HTNV感染系数≥1.5，则该孔为阳性，否则为阴性；其中，NIR本底值为本底组四个孔NIR的算术平均值，微孔板的阳性对照组HTNV感染系数≥1.5是采用该组检测结果否则重复此板结果；2)计算中和比值之和，每个稀释梯度的中和比值＝阴性孔/复孔总数中和比值之和＝所有稀释梯度的感染比值之和3)计算稀释组距，将梯度稀释比例换算成10的指数，以指数等差排列的公差作为稀释组距；4)计算中和滴度，用Karber法分别测定LgPD50(半数保护量)及中和效价LgPD50＝L+D×(S－0.5)；中和效价＝PD50；其中，L为最低稀释度的对数；D为稀释组距；S为中和比值之和。所述的一抗包括抗HTNVNP鼠单抗，以及抗β-actin兔多抗；所述的二抗包括Goatanti-rabbitIRDyeTM680和Goatanti-mouseIRDyeTM800CW，分别用以检测700nm和800nm通道的荧光强度。在A549细胞感染HTNV后第二天进行ICW检测。所述A549细胞感染HTNV的感染剂量为MOI＝0.1。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术优化了ICW检测HTNV感染细胞的最适时间、所用病毒的最适剂量，筛选了ICW所用的抗病毒蛋白抗体，并进行了标准化。本专利技术可用于测定HTNV滴度(组织细胞培养半数感染量TCID50)、检测HTNV中和抗体效价、筛选和鉴定抗HTNV分子、评价人HTNV疫苗免疫保护性等。除HTNV外，其他无CPE或无明显CPE病毒(如丙型肝炎病毒)的相关检测也可参考本专利技术实施，但所用抗体应根据所测病毒而定。本专利技术具有以下优点：1、直接检测，操作简单；2、检测周期短(72小时)；3、灵敏度高，5pg-100ng蛋白ICW所测荧光强度与蛋白量成正相关；4、可重复性好；5、结果判读客观；6、高通量；7、检测成本低；8、方法可标准化，便于实验室间推广。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，其特征在于，包括以下操作：1)将A549细胞均匀接种于ICW用微孔板中，培养至80～90％的细胞汇合度；2)待步骤1)中细胞汇合度达到70～80％时，采用固定病毒稀释样本的方法进行混合液的制备：将待测样本等比梯度稀释，每个稀释比例的待测样本分别与等体积的HTNV混合，于37℃孵箱中孵育2h，期间轻柔地颠倒混匀数次；3)吸弃步骤1)微孔板中的培养液，每孔加入DPBS洗涤1‑2次，然后将步骤(2)中孵育完成的混合液加入微孔板，每个稀释梯度设多个重复样，加样顺序按照从低到高进行；同时设置病毒阴性对照组、同型对照组、病毒阳性对照组、空白对照组；4)将步骤(3)中的微孔板放入37℃孵箱孵育2.5h后吸弃混合液，每孔加入洗涤1‑2次，再向每孔加入含有2％FBS的DMEM；5)将步骤4)中微孔板放入37℃孵箱孵育2d后取出进行ICW检测；6)ICW检测HTNV感染细胞内的NP：首先吸弃微孔板中的培养液，加入PBS洗涤；然后向每孔中加入4℃预冷的固定缓冲液进行固定，免摇动在室温条件下孵育；吸弃固定缓冲液，用透膜缓冲液洗脱细胞；吸弃透膜缓冲液，沿管壁向每孔加入封阻液，在摇床上缓慢上摇动室温下孵育；吸弃封阻液，沿管壁向每孔加入一抗，室温下缓慢摇动孵育；吸弃一抗，加入洗涤缓冲液，洗涤多次；吸弃洗涤缓冲液，沿管壁向每孔加入二抗，室温下避光缓慢摇动，孵育；加入洗涤缓冲液，室温下避光缓慢摇动，洗涤多次；洗脱结束之后，完全去除洗脱液；最后，洗脱后的微孔板采用近红外双色荧光成像系统进行扫描，使用700nm和800nm两个通道同时扫描，以获取HTNV NP的红外荧光强度；7)计算HTNV中和抗体效价：获得每孔在700nm和800nm通道的红外荧光强度，然后计算每孔中HTNV NP红外荧光强度相对比NIR，NIR＝NP荧光值/内参蛋白荧光值；再利用Karber方法计算获得待测样本中和滴度，即中和抗体效价。...

【技术特征摘要】
1.一种高通量快速检测汉滩病毒中和抗体效价的方法，其特征在于，包括以下操作：1)将A549细胞均匀接种于ICW用微孔板中，培养至80～90％的细胞汇合度；2)待步骤1)中细胞汇合度达到70～80％时，采用固定病毒稀释样本的方法进行混合液的制备：将待测样本等比梯度稀释，每个稀释比例的待测样本分别与等体积的HTNV混合，于37℃孵箱中孵育2h，期间轻柔地颠倒混匀数次；3)吸弃步骤1)微孔板中的培养液，每孔加入DPBS洗涤1-2次，然后将步骤(2)中孵育完成的混合液加入微孔板，每个稀释梯度设多个重复样，加样顺序按照从低到高进行；同时设置病毒阴性对照组、同型对照组、病毒阳性对照组、空白对照组；4)将步骤(3)中的微孔板放入37℃孵箱孵育2.5h后吸弃混合液，每孔加入洗涤1-2次，再向每孔加入含有2％FBS的DMEM；5)将步骤4)中微孔板放入37℃孵箱孵育2d后取出进行ICW检测；6)ICW检测HTNV感染细胞内的NP：首先吸弃微孔板中的培养液，加入PBS洗涤；然后向每孔中加入4℃预冷的固定缓冲液进行固定，免摇动在室温条件下孵育；吸弃固定缓冲液，用透膜缓冲液洗脱细胞；吸弃透膜缓冲液，沿管壁向每孔加入封阻液，在摇床上缓慢上摇动室温下孵育；吸弃封阻液，沿管壁向每孔加入一抗，室温下缓慢摇动孵育；吸弃一抗，加入洗涤缓冲液，洗涤多次；吸弃洗涤缓冲液，沿管壁向每孔加入二抗，室温下避光缓慢摇动，孵育；加入洗涤缓冲液，室温下避光缓慢摇动，洗涤多次；洗脱结束之后，完全去除洗脱液；最后，洗脱后的微孔板采用近红外双色荧光成像系统进行扫描，使用700nm和800nm两个通道同时扫描，以获取HTNVNP的红外荧光强度；7)计算HTNV中和抗体效价：获得每孔在700nm和800nm通道的红外荧光强...

【专利技术属性】
技术研发人员：张芳琳，马宏炜，雷迎峰，张亮，程林峰，陈何嵩，石静琦，韩佩君，叶伟，吴兴安，徐志凯，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61