瘦蛋白mRNA组合物和制剂制造技术

包含修饰的合成信使RNA和递送剂的制剂。修饰的合成信使RNA编码瘦蛋白蛋白质，是不复制的并且是翻译‑准备好的。可以向患有先天性瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍或其中循环中的瘦蛋白水平是低的其它病况的受试者递送制剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利
本专利技术一般地涉及影响生命或身体吃的多核苷酸组合物，并且具体地涉及通过向受试者施用编码人瘦蛋白蛋白质的修饰的、合成的、非复制的信使核糖核酸(mRNA)来治疗患有先天的瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍或其中循环中的瘦蛋白水平低的其它病况的受试者。专利技术背景瘦蛋白是由白色脂肪组织生产并且分泌到个体的循环系统中的激素。循环的瘦蛋白进入个体的大脑，在那里它与瘦蛋白受体结合而通过激活几个信号转导级联来调节食欲(饱食的感觉)、能量代谢和神经内分泌的功能。先天性瘦蛋白缺乏是由瘦蛋白基因的突变所引起的。患有先天性瘦蛋白缺乏的个体贪得无厌地吃并且变成病态地肥胖的，遭受肥胖的结果，包括性腺机能减退和糖尿病。患有引起一般化的脂肪代谢障碍(接近完全的缺少脂肪组织)的瘦蛋白突变或单基因突变的个体也具有不足的瘦蛋白水平。这些患有脂肪代谢障碍和低瘦蛋白水平的个体是瘦的，但是发展饮食过多、严重的脂质异常和糖尿病。采用重组的瘦蛋白蛋白质治疗逆转这些效果。Licinio J等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(13):4531-6显示在遵照瘦蛋白蛋白质治疗的缺乏瘦蛋白的肥胖成人中重量减轻。用美曲普汀(metreleptin)(重组瘦蛋白蛋白质)以皮下方式治疗患者持续18个月，导致增加的物理活动、II型糖尿病和性腺机能减退两者的解决和体重指数的减小。Ebihara K等人(2007)J.Clin.Endocrinol.Metab.92 532–541在患有一般化脂肪代谢障碍的患者中显示:采用美曲普汀通过每日注射两次治疗40个月在1个星期之内开始改善了空腹葡萄糖和甘油三酯水平。瘦蛋白替代疗法减小了胰岛素抗性并且增加了胰岛素分泌。美曲普汀疗法对糖尿病和脂肪代谢障碍并发症有益处。Chan JL等人(2011)Endocr.Pract.17(6):922-932显示:美曲普汀疗法使在脂肪代谢障碍患者中的代谢异常正常化。特别地，Chan等人(2011)显示:在贯穿3年的治疗期间，美曲普汀疗法减小血红蛋白A1c和甘油三酯水平。然而，瘦蛋白蛋白质难以生产并且具有短的半衰期、需要每日皮下(SC)给药一次或两次。因此，在本领域中存在着对于通过把瘦蛋白给药方案从每日两次减少到每几天一次或甚至更小的频度而改善患者护理标准的需要。专利技术概述本专利技术提供可用于矫正受试者瘦蛋白缺乏的制剂。该制剂可以有利地每几天施用给受试者一次，在体内以最低的免疫活化并且以瘦蛋白蛋白质的受控表达。所述制剂的一种组分是修饰的合成瘦蛋白信使核糖核酸(mRNA)。对mRNA的修饰提供改善的mRNA稳定性和减小的免疫原性。修饰的合成瘦蛋白mRNA的合成可以借助于包括体外转录在内的几种方法中的任何一种。在一种实施方式中，在瘦蛋白mRNA的体外转录期间，通过采用假尿嘧啶核苷(Ψ)取代瘦蛋白mRNA中的尿嘧啶核苷而在其合成期间修饰瘦蛋白mRNA。在具体的实施方式中，瘦蛋白mRNA中所有的尿嘧啶核苷被假尿嘧啶核苷取代。在一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白具有在自然界中发现的编码序列。在备选的实施方式中，修饰的合成瘦蛋白具有密码子优化的编码序列。在一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白具有编码序列，其编码在功能上与天然人瘦蛋白蛋白质等同的蛋白质。制剂的另一种组分是递送剂。在一种实施方式中，递送剂是脂质纳米微粒。在一种实施方式中，阳离子脂质纳米微粒包括:(i)用于包裹和用于内体脱逸的阳离子脂质，(ii)用于稳定化的中性脂质，(iii)也用于稳定化的辅助脂质，和(iv)防止聚集的隐型脂质(stealth lipid)。在更具体的实施方式中，阳离子脂质可以是阳离子脂质A、阳离子脂质B、阳离子脂质C或阳离子脂质D；辅助脂质是胆固醇；并且隐型脂质是聚乙二醇(PEG)脂质(“脂质化的PEG”)。在另一种实施方式中，把改善的脂质纳米微粒用作递送剂来在个体的细胞中提供改善的瘦蛋白蛋白质的表达以及在个体的循环中提供增加的瘦蛋白。在另一种实施方式中，辅助脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在又一种实施方式中，隐型脂质是S024(进一步在本文中描述)。在另一种实施方式中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比率在3:1和8:1之间。本专利技术也提供向患有瘦蛋白缺乏的受试者施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的方法。受试者可具有病况，例如先天性和获得性一般化脂肪代谢障碍(其中具有非常低的瘦蛋白水平、获得性HIV脂肪代谢障碍(其中具有低的瘦蛋白水平)、下丘脑性闭经或肥胖(特别地，患有减少瘦蛋白水平的那些受试者)。可以向受试者体内或向器官或组织离体施用修饰的合成瘦蛋白mRNA以在器官中或在脂肪组织中诱导瘦蛋白蛋白质的外源性表达。因此，可以以最低的癌症风险把本专利技术修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂用于类似于基因疗法的目的，因为不能在哺乳动物细胞中逆转录mRNA而产生可能形成染色体插入风险的DNA拷贝。在一种实施方式中，以静脉内方式向个体施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。在另一种实施方式中，以皮下方式施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。在又一种实施方式中，首先以静脉内方式施用，然后以皮下方式施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。可以以重复的剂量施用修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。在一种实施方式中，以至少0.2mg瘦蛋白mRNA/kg受试者的体重的剂量递送本专利技术修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。在另一种实施方式中，以至少0.6mg瘦蛋白mRNA/kg受试者的体重的剂量递送本专利技术修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。本专利技术具有几个优点。所述优点中的一个是可以以比施用瘦蛋白蛋白质所需要的给药(它是每日皮下给药一次或两次)更小的频度，向个体给药制剂。在一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的施用可以是每三天一次。在另一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的施用可以是每个星期一次。在一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白mRNA被包裹在脂质纳米微粒复合体中，其向个体提供低的免疫原性。在另一种实施方式中，修饰的合成瘦蛋白mRNA被有利地包裹在可生物降解的递送剂中。所述优点中的一个是向受试者施用制剂，递送足以在体内导致药学上活性的瘦蛋白水平的修饰的合成瘦蛋白mRNA。正如本文中描述的那样，已经测定了用于抑制食物摄取的本专利技术修饰的合成瘦蛋白在血浆中的EC50浓度值为1.4ng/mL(85pM)。在一种实施方式中，向受试者施用本专利技术修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂，使得施用导致瘦蛋白蛋白质的血浆浓度为至少2.8ng/毫升，该值是用于减少缺乏瘦蛋白的ob/ob小鼠体重的人瘦蛋白蛋白质浓度的EC50的两倍。在另一种实施方式中，递送修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂导致1.4ng/mL的瘦蛋白蛋白质的血浆浓度。在又一种实施方式中，递送修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂导致185ng/mL的血浆浓度。在另一种实施方式中，递送修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂导致1300ng/mL的血浆瘦蛋白蛋白质浓度。在一种实施方式中，以足以使血浆瘦蛋白蛋白质浓度至少比施用以前受试者的基线瘦蛋白蛋白质浓度高10ng/mL的数量，向受试者施用本专利技术修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂。本专利技术给被施用了本专利技术修饰的合成瘦蛋白mRNA制剂的受试者提供了几种了可测量的益处本文档来自技高网...

【技术保护点】
制剂，其包含:(a)核糖核酸(RNA)多核苷酸，(i)其中多核苷酸编码瘦蛋白蛋白质，并且(ii)其中多核苷酸包括假尿嘧啶核苷核苷酸；和(b)递送剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.19 US 61/918,161;2014.01.31 US 61/933,9641.制剂，其包含:(a)核糖核酸(RNA)多核苷酸，(i)其中多核苷酸编码瘦蛋白蛋白质，并且(ii)其中多核苷酸包括假尿嘧啶核苷核苷酸；和(b)递送剂。2.权利要求1的制剂，其中编码的瘦蛋白蛋白质是人瘦蛋白蛋白质。3.权利要求1-2中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸不包括尿嘧啶核苷核苷酸。4.权利要求1-3中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸包含编码区，其与选自由SEQ ID NOS:17-20组成的组的序列具有至少78％的序列同一性。5.权利要求1-3中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸包含编码区，其与选自由SEQ ID NOS:17-20组成的组的序列具有至少90％的序列同一性。6.权利要求1-3中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸包含选自由SEQ ID NOS:17-20组成的组的序列。7.权利要求1-3中任意一项的制剂，其中核糖核酸多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10组成的组的序列。8.权利要求1-7中任意一项的制剂，其中制剂是脂质纳米微粒(LNP)。9.权利要求1-8中任意一项的制剂，其中递送剂包括阳离子脂质、中性脂质、辅助脂质和隐型脂质。10.权利要求9的制剂，其中阳离子脂质与核糖核酸多核苷酸的摩尔比率在3:1和8:1之间。11.权利要求9-10中任意一项的制剂，其中阳离子脂质选自由阳离子脂质A、阳离子脂质B、阳离子脂质C和阳离子脂质D组成的组。12.权利要求9-11中任意一项的制剂，其中中性脂质是1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。13.权利要求9-12中任意一项的制剂，其中辅助脂质是胆固醇。14.权利要求9-13中任意一项的制剂，其中隐型脂质是聚乙二醇(PEG)脂质。15.权利要求9-14中任意一项的制剂，其中隐型脂质是S024。16.权利要求1-15中任意一项的制剂，其中递送剂包括阳离子脂质、胆固醇、中性脂质和聚乙二醇(PEG)脂质。17.权利要求1-16中任意一项的制剂，用作药物。18.权利要求1-17中任意一项的制剂，用于治疗瘦蛋白缺乏、脂肪代谢障碍或其中循环中的瘦...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·拜尔斯，S·L·卡普兰，G·G·甘伯，S·哈姆，K·A·黑尔德魏因，I·斯普劳斯基，T·扎巴瓦，F·泽克里，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH