硫酸软骨素用于扩增CIK细胞、制备CIK细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途制造技术

本发明专利技术公开了硫酸软骨素用于扩增CIK细胞、制备CIK细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途，该高分子量硫酸软骨素由动物胸软骨来源的硫酸软骨素经酸降解制备而得，高分子量指分子量范围为14.2‑15.6kD。本发明专利技术提供的高分子量硫酸软骨素可以显著提高CIK细胞的扩增活力和杀瘤活性，可以用于制备商品化的CIK细胞培养基和培养器皿。

Use of chondroitin sulfate for amplification of CIK cells, preparation of CIK cell amplification reagents and package culture utensils

The invention discloses a chondroitin sulfate for the amplification of CIK cells, CIK cells and preparation of amplification reagent coated culture vessel uses the high molecular weight chondroitin sulfate by chondroitin sulfate from animal cartilage chest prepared by acid degradation, high molecular weight refers to the range of molecular weight is 14.2 15.6kD. The high molecular weight chondroitin sulfate provided by the invention can significantly improve the amplification activity and tumor killing activity of CIK cells, and can be used for the preparation of commercialized CIK cell culture media and culturing containers.

【技术实现步骤摘要】
硫酸软骨素用于扩增CIK细胞、制备CIK细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途
本专利技术属于细胞免疫领域，涉及CIK细胞，具体涉及硫酸软骨素用于扩增CIK细胞、制备CIK细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途。
技术介绍
硫酸软骨素(chondroitinsulfate,CS)广泛存在于各种动物组织中，尤其在软骨和结缔组织中含量丰富。由于不同生物或者相同生物的不同组织所含CS的种类和量均不同，使其结构与活性复杂多样。作为一类重要的生物大分子，CS具有广泛的生物活性，作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。大量研究表明，CS具有降血脂、抗动脉粥样硬化和抗病毒性肝炎等活性，临床中已用于防治关节炎、肾炎、神经痛、偏头痛等。CS属于糖胺聚糖类(Glycosaminoglycans，GAGs)物质，以蛋白聚糖的形式广泛分布于动物的软骨、皮肤、玻璃体及血管等组织中，在软骨组织中尤其丰富，是软骨的重要组成成分。CS是一类含有聚阴离子的线性多糖，由D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)构成的二糖单位以[4)-β-GlcA-(13)-β-GalNAc-(1]的序列重复连接组成骨架结构，并在后续的生物合成过程中在不同的位置引入硫酸基。不同来源及提取方法得到的CS其硫酸化的位点和程度、相对分子质量(Mr)均存在差异，而这是影响CS生物活性的关键因素。生物治疗是继手术、化疗及放疗3种传统模式之后的第4大肿瘤治疗模式，前3种模式或毒副作用较大，或不能清除体内残存肿瘤细胞，大部分肿瘤患者终因复发或难治而导致死亡。细胞免疫治疗技术在肿瘤的生物治疗中占有重要地位,显示出良好的应用前景，并逐渐成为肿瘤治疗的重要手段之一。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercell，CIK)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤生物免疫治疗的主力军。CIK细胞的主要效应细胞为CD3+CD56+表型T淋巴细胞，兼有NK细胞和T细胞的特征。在功能上，CIK一方面拥有T淋巴细胞强大抗肿瘤活性，另一方面拥有NK细胞非MHC限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。CIK细胞的扩增活力和杀瘤活性直接关系到治疗成本和效果。目前尚未见硫酸软骨素在CIK细胞培养扩增方面的应用。
技术实现思路
本专利技术旨在提供硫酸软骨素用于扩增CIK细胞、制备CIK细胞扩增试剂和包被培养器皿的用途，以提高CIK细胞的扩增活力和杀瘤活性，降低细胞治疗成本并提升治疗效果。本专利技术通过如下技术方案得以实现：一种高分子量硫酸软骨素，由动物胸软骨来源的硫酸软骨素经酸降解制备而得，所述高分子量指分子量范围为14.2-15.6kD。优选地，所述酸为苹果酸。优选地，所述酸降解的方法包括如下步骤：配制质量体积浓度为2-4％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.1-0.3mol/L，于60-80℃搅拌降解8-12h，用足量的碱性物质终止反应，并调节pH至6.5，加入乙醇沉淀，分离干燥即得所述的高分子量硫酸软骨素。优选地，所述碱性物质为碳酸钙。优选地，所述动物胸软骨指鸡胸软骨。优选地，鸡胸软骨来源的硫酸软骨素的制备方法包括如下步骤：将鸡胸软骨用木瓜蛋白酶于50-60℃提取5.5-6.5h得到酶提液，经三氯乙酸去除蛋白质后抽滤离心，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min，上清液浓缩后用乙醇沉淀，离心收集沉淀，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min；沉淀透析脱盐后，再用阳离子交换树脂、葡聚糖凝胶柱层析纯化即得鸡胸软骨来源的硫酸软骨素。上述硫酸软骨素在CIK细胞培养方面的应用。一种用于CIK细胞培养的培养基，含有有效浓度的上述硫酸软骨素。优选地，上述培养基内还含有叶绿素。一种用于CIK细胞培养的培养器皿，培养器皿内壁包被有有效厚度的包被层，包被层的材料为上述硫酸软骨素。优选地，上述培养器皿内部用氩气填充密封。本专利技术优点：本专利技术提供的高分子量硫酸软骨素可以显著提高CIK细胞的扩增活力和杀瘤活性，可以用于制备CIK细胞培养基和培养器皿。附图说明图1为高分子量硫酸软骨素与硫酸软骨素原料的红外光谱图对比。具体实施方式为了更好地解释本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：高分子量硫酸软骨素的制备和表征1、鸡胸软骨来源的硫酸软骨素的制备：将新鲜的鸡胸软骨去筋膜后，55℃烘干粉碎过40目筛得软骨粉，将软骨粉溶于质量体积百分含量为8％的木瓜蛋白酶溶液中(5g软骨粉对应1L溶液)，用木瓜蛋白酶于55℃提取6h得到酶提液，加入三氯乙酸至体积浓度为10％，反应1.5小时经三氯乙酸去除蛋白质后抽滤离心，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min，上清液浓缩后用乙醇沉淀(95％乙醇体积为上清液体积的5倍)，离心收集沉淀，离心条件为4000-5000rpm离心8-12min。沉淀用去离子水复溶透析脱盐后，再用732#阳离子交换树脂、SEPHACRYLS-300HR葡聚糖凝胶柱层析纯化、冷冻干燥即得鸡胸软骨来源的硫酸软骨素(下文称硫酸软骨素原料)。2、高分子量硫酸软骨素的制备制备实例1：将上述硫酸软骨素原料用去离子水溶解配制成质量体积浓度为3％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.2mol/L，于70℃搅拌降解10h，用足量的碳酸钙粉末终止反应，并调节pH至6.5，加入乙醇沉淀(95％乙醇体积为降解溶液体积的8倍)，离心后55℃烘干即得所述的高分子量硫酸软骨素。制备实例2：将上述硫酸软骨素原料用去离子水溶解配制成质量体积浓度为2％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.1mol/L，于60℃搅拌降解12h，用足量的碳酸钙粉末终止反应，并调节pH至6.5，加入乙醇沉淀(95％乙醇体积为降解溶液体积的8倍)，离心后55℃烘干即得所述的高分子量硫酸软骨素。制备实例3：将上述硫酸软骨素原料用去离子水溶解配制成质量体积浓度为4％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.3mol/L，于80℃搅拌降解8h，用足量的碳酸钙粉末终止反应，并调节pH至6.5，加入乙醇沉淀(95％乙醇体积为降解溶液体积的8倍)，离心后55℃烘干即得所述的高分子量硫酸软骨素。3、分析与测试硫酸软骨素分子量采用《中国药典》(2010版)中高效液相色谱法测定，结果如下表：红外吸收光谱测试：KBr压片，4000～400cm-1波数范围扫描。结果如图1所示，图1上面的红外图谱为硫酸软骨素原料的红外图谱，图1下为制备实例1制备的高分子量硫酸软骨素，制备实例2和3与制备实例1图谱基本一致。从红外图谱可以看出，上述酸水解方法非常温和，未造成硫酸软骨素化学基团的破坏，仅仅是使其断裂分子量减少。实施例2：高分子量硫酸软骨素对CIK细胞扩增活力和杀瘤活性的影响一、实验材料10％胎牛血清和RPMI-1640培养液购于Gibco公司，淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司(TBD)，IL-2购自北京双鹭药业股份有限公司，抗人CD3单抗购自Gibco公司，IFN-γ购自美国PEPROTEC公司，IL-1α购自美国P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高分子量硫酸软骨素，其特征在于：由动物胸软骨来源的硫酸软骨素经酸降解制备而得，所述高分子量指分子量范围为14.2‑15.6kD。

【技术特征摘要】
1.一种高分子量硫酸软骨素，其特征在于：由动物胸软骨来源的硫酸软骨素经酸降解制备而得，所述高分子量指分子量范围为14.2-15.6kD。2.根据权利要求1所述的高分子量硫酸软骨素，其特征在于，所述酸降解的方法包括如下步骤：配制质量体积浓度为2-4％的硫酸软骨素溶液，加入苹果酸至浓度为0.1-0.3mol/L，于60-80℃搅拌降解8-12h，用足量的碱性物质终止反应，并调节pH至6.5，加入乙醇沉淀，分离干燥即得所述的高分子量硫酸软骨素。3.根据权利要求2所述的高分子量硫酸软骨素，其特征在于：所述碱性物质为碳酸钙。4.根据权利要求1所述的高分子量硫酸软骨素，其特征在于：动物胸软骨指鸡胸软骨。5.根据权利要求4所述的高分子量硫酸软骨素，其特征在于，鸡胸软骨来源的硫酸软骨素的制备方法包括如下步骤：将鸡胸软骨用木瓜蛋白酶于50-60℃提取5....

【专利技术属性】
技术研发人员：胡攀勇，张钟祥，胡珂，
申请(专利权)人：南京佰泰克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32