基于转座酶的基因组分析制造技术

提供了用于使用分区(例如，液滴)技术同时避免在液滴中进行扩增来对DNA样品进行条码化和分析的方法和试剂。

Genome analysis based on transposase

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于转座酶的基因组分析相关申请的交叉引用本申请要求2017年11月2日提交的美国临时申请第62/580,946号的权益，为所有目的其全文通过引用全文纳入本文。序列表本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用全文纳入本文。2018年10月31日创建的所述ASCII拷贝，命名为094868-1103056_115910PC_SL.txt，大小为3,345字节。
技术介绍
现代测序文库的制备通常涉及引入Tn5转座酶的高活性变体，该变体介导双链DNA的片段化并在5分钟的反应中将合成的寡核苷酸两端连接(AdeyA等，GenomeBiol11：R119(2010))。野生型Tn5转座子是复合型转座子，其中2个几乎相同的插入序列(IS50L和IS50R)侧接3个抗生素抗性基因(ReznikoffWS.AnnuRevGenet42：269-286(2008))。各IS50包含2个反向19-bp末端序列(ES)，外侧端(outsideend，OE)和内侧端(insideend，IE)。然而，野生型ES的活性相对较低并且被过分活跃的镶嵌端(mosaicend，ME)序列体外取代。因此，具有19-bpME的转座酶复合物是转座发生所必需的，只要间插DNA足够长以使这些序列中的两个靠近在一起形成活性Tn5转座酶同二聚体(ReznikoffWS.，MolMicrobiol47：1199-1206(2003))。转座在体内是非常罕见的事件，并且过分活跃的突变体历史上源自Tn5蛋白的476个残基中导入三个错义突变(E54K、M56A、L372P)，其由IS50R编码(GoryshinIY，ReznikoffWS.1998.JBiolChem273：7367-7374(1998))。转座通过“剪切-和-粘贴”机制起作用，其中Tn5将其从供体DNA中切除并插入靶序列，产生靶标的9-bp重复(SchallerH.ColdSpringHarbSympQuantBiol43：401-408(1979)；ReznikoffWS.，AnnuRevGenet42：269-286(2008))。在当前的商业解决方案(NexteraDNA试剂盒，亿明达公司(Illumina))中，游离的合成ME衔接子与靶DNA的5′-末端通过转座酶末端连接。专利技术概述在一些实施方式中，提供了条码化DNA的方法。在一些实施方式中，该方法包括通过使DNA与载有寡核苷酸衔接子的转座酶接触向DNA中随机引入寡核苷酸衔接子，其中寡核苷酸衔接子包含3′单链部分和双链部分，第一寡核苷酸具有3′末端和5′末端并且是双链部分的链，第二寡核苷酸包含单链部分和双链部分的互补链，和其中转座酶将双链断裂引入DNA中，其中每个双链断裂形成两个DNA末端，并且转座酶将第一寡核苷酸连接至每个DNA末端的一条链，以形成在两端包含寡核苷酸衔接子的DNA片段；形成液滴，其中所述液滴包含DNA片段和具有珠特异性条码序列的第一寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物与珠连接，并包含与寡核苷酸衔接子的3′单链部分互补的游离3′末端；使第一寡核苷酸引物(可选地从珠释放)的3′末端与寡核苷酸衔接子的3′单链部分杂交；合并液滴的内容物以形成反应混合物；使反应混合物与连接酶接触，从而将第一寡核苷酸引物连接至与DNA末端连接的第一寡核苷酸的5′末端，从而形成条码化的DNA片段。在一些实施方式中，该方法进一步包括扩增条码化的片段。在一些实施方式中，扩增包括聚合酶链式反应。在一些实施方式中，该方法包括在杂交之前从DNA中剥离转座酶。在一些实施方式中，剥离发生在液滴中。在一些实施方式中，DNA在核中，并且剥离在液滴形成之前发生。在一些实施方式中，该方法包括在杂交之前从珠上切割寡核苷酸引物。在一些实施方式中，转座酶载有具有相同的双链部分和不同的单链部分的两个不同的衔接子寡核苷酸。在一些实施方式中，液滴还包含第二寡核苷酸引物，其中第二寡核苷酸引物包含与单链部分之一至少50％(例如，至少60％，70％，80％，90％或100％)互补的3′末端序列，并且第一寡核苷酸引物包含与不同的3′单链部分至少50％(例如60％，70％，80％，90％或100％)互补的游离3′末端，并且杂交包括使第二寡核苷酸引物与互补的3′单链部分杂交。在一些实施方式中，一个单链部分包含GACGCTGCCGACGA(A14；SEQIDNO：1)，而另一个单链部分包含CCGAGCCCACGAGAC(B15；SEQIDNO：2)。在一些实施方式中，转座酶载有两个相同的衔接子寡核苷酸。在一些实施方式中，第一寡核苷酸引物包含5′PCR柄序列。在一些实施方式中，第一寡核苷酸引物的5′PCR柄序列包含AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(P5；SEQIDNO：3)。在一些实施方式中，液滴进一步包含第二寡核苷酸引物，并且其中第二寡核苷酸引物包含5′PCR柄。在一些实施方式中，第二寡核苷酸引物的5′PCR柄包括CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(P7；SEQIDNO：4)。在一些实施方式中，第二寡核苷酸引物进一步包含索引标签(例如，条码)。在一些实施方式中，第二寡核苷酸的单链部分包括：i.与第一寡核苷酸引物小于50％互补的3′末端序列；和ii.与第一寡核苷酸引物的游离3’末端至少50％(例如，至少60％，70％，80％，90％或100％)互补的中间序列。在一些实施方式中，DNA在引入过程中包含DNA结合的蛋白质。在一些实施方式中，该方法进一步包括在合并后从DNA中去除DNA结合的蛋白质。在一些实施方式中，去除包括使DNA与离液剂或蛋白酶接触。在一些实施方式中，该方法进一步包括在合并前从DNA中去除DNA结合的蛋白质。在一些实施方式中，去除包括使DNA与离液剂或蛋白酶接触。在一些实施方式中，与DNA相比，该形成维持DNA片段的相邻性(contiguity)。在一些实施方式中，DNA在合并之后和接触之前被纯化。在一些实施方式中，该方法进一步包括在合并期间，将液滴的内容物与包含单链部分的竞争性寡核苷酸混合，该竞争性寡核苷酸与第一寡核苷酸引物的未结合拷贝的3′末端杂交，从而防止合并后未结合的DNA片段的从头结合。在一些实施方式中，该方法进一步包括在合并期间，将液滴的内容物与包含单链部分的竞争性寡核苷酸混合，该竞争性寡核苷酸与寡核苷酸衔接子的未结合拷贝的3′末端杂交，从而防止合并后未结合的DNA片段的从头结合。在一些实施方式中，竞争性寡核苷酸包含不能通过聚合酶延伸的3′末端。在一些实施方式中，接触中的聚合酶是链置换聚合酶。在一些实施方式中，接触中的聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性。在一些实施方式中，转座酶是TN5转座酶。在一些实施方式中，转座酶与珠连接。在一些实施方式中，该方法进一步包括对条码化的DNA序列进行测序，其中测序包括杂交测序引物并将其延伸至条码化的DNA序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种条码化DNA的方法，所述方法包括通过使DNA与载有寡核苷酸衔接子的转座酶接触向DNA中随机引入寡核苷酸衔接子，/n其中寡核苷酸衔接子包含3′单链部分和双链部分，第一寡核苷酸具有3′末端和5′末端并且是双链部分的链，第二寡核苷酸包含单链部分和双链部分的互补链，和/n其中转座酶将双链断裂引入DNA中，其中每个双链断裂形成两个DNA末端，并且转座酶将第一寡核苷酸连接至每个DNA末端的一条链，以形成在两端包含寡核苷酸衔接子的DNA片段；/n形成液滴，其中所述液滴包含DNA片段和具有珠特异性条码序列的第一寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物与珠连接，并包含与寡核苷酸衔接子的3′单链部分互补的游离3′末端；/n使第一寡核苷酸引物(可选地从珠释放)的3′末端与寡核苷酸衔接子的3′单链部分杂交；/n合并液滴的内容物以形成反应混合物；/n使反应混合物与连接酶接触，从而将第一寡核苷酸引物连接至与DNA末端连接的第一寡核苷酸的5′末端，从而形成条码化的DNA片段。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171102 US 62/580,9461.一种条码化DNA的方法，所述方法包括通过使DNA与载有寡核苷酸衔接子的转座酶接触向DNA中随机引入寡核苷酸衔接子，
其中寡核苷酸衔接子包含3′单链部分和双链部分，第一寡核苷酸具有3′末端和5′末端并且是双链部分的链，第二寡核苷酸包含单链部分和双链部分的互补链，和
其中转座酶将双链断裂引入DNA中，其中每个双链断裂形成两个DNA末端，并且转座酶将第一寡核苷酸连接至每个DNA末端的一条链，以形成在两端包含寡核苷酸衔接子的DNA片段；
形成液滴，其中所述液滴包含DNA片段和具有珠特异性条码序列的第一寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物与珠连接，并包含与寡核苷酸衔接子的3′单链部分互补的游离3′末端；
使第一寡核苷酸引物(可选地从珠释放)的3′末端与寡核苷酸衔接子的3′单链部分杂交；
合并液滴的内容物以形成反应混合物；
使反应混合物与连接酶接触，从而将第一寡核苷酸引物连接至与DNA末端连接的第一寡核苷酸的5′末端，从而形成条码化的DNA片段。


2.如权利要求1所述的方法，还包括扩增所述条码化的片段。


3.如权利要求2所述的方法，其中所述扩增包括聚合酶链式反应。


4.如权利要求1所述的方法，包括在杂交之前从DNA中剥离转座酶。


5.如权利要求4所述的方法，其中所述剥离发生在液滴中。


6.如权利要求4所述的方法，其中DNA在核中，并且剥离在液滴形成之前发生。


7.如权利要求1所述的方法，包括在杂交之前从珠切割寡核苷酸引物。


8.如权利要求1所述的方法，其中所述转座酶载有具有相同的双链部分和不同的单链部分的两个不同的衔接子寡核苷酸。


9.如权利要求8所述的方法，其中所述液滴还包含第二寡核苷酸引物，其中第二寡核苷酸引物包含与单链部分之一至少50％(例如，至少60％，70％，80％，90％或100％)互补的3′末端序列，并且第一寡核苷酸引物包含与不同的3′单链部分至少50％(例如60％，70％，80％，90％或100％)互补的游离3′末端，并且杂交包括使第二寡核苷酸引物与互补的3′单链部分杂交。


10.如权利要求9所述的方法，其中一个单链部分包含GACGCTGCCGACGA(A14；SEQIDNO：1)，而另一个单链部分包含CCGAGCCCACGAGAC(B15：SEQIDNO：2)。


11.如权利要求1所述的方法，其中所述转座酶载有两个相同的衔接子寡核苷酸。


12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸引物包含5’PCR柄序列。


13.如权利要求12所述的方法，其中第一寡核苷酸引物的5′PCR柄序列包含AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(P5；SEQIDNO：3)。

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【专利技术属性】
技术研发人员：R·雷伯弗斯基，J·陈，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US